A P elem technikák: enhanszerek és szupresszorok azonosítása

Az előadások a következő témára: "A P elem technikák: enhanszerek és szupresszorok azonosítása"— Előadás másolata:

1 A P elem technikák: enhanszerek és szupresszorok azonosítása
Génmanipuláció ecetmuslicában: P elem technikák A P elem technikák: enhanszerek és szupresszorok azonosítása

2 Klasszikus mutagenezis kísérletek korlátai
Egy adott biológiai folyamatban részt vevő, vagy azt szabályozó gének közül nem mindegyiket lehet azonosítani klasszikus mutagenezis kísérletekben nyilvánvaló fenotípus hiánya anyai hatás Több biológiai folyamatban is szerepet játszó gének esetében csak az első eszenciális funkció tanulmányozható Az egyik lehetséges módszer a klasszikus mutagenezisben nem található gének azonosítására az enhanszerek és szupreszorok izolálása. Másik alkalmazott módszer erre amutációk fenotípusának analízise szomatikus, vagy mitótikus klónokban.

3 Enhanszerek és szupresszorok azonosítása
Hsp70 terminátor szekvencia eyeless P promóter gén Gal4 mini-white ori amp E B Gal4 vizsgált gén 5xUAS

4 A P elem technikák: helyspecifikus rekombináció
Génmanipuláció ecetmuslicában: P elem technikák A P elem technikák: helyspecifikus rekombináció

5 Szomatikus klónok előállítása Flp rekombinázzal
FRT Flp rekombináz helyspecifikus rekombinációt indukál FRT szekvenciák között Élesztőkben a 2μ plazmid replikációjában vesz részt Kiválóan működik Drosophilában FRT helyeket hordozó transzgénikus legyekben mitótikus klónokat lehet létrehozni Flp-függő rekombinációval Centromer közeli FRT helyeket hordozó transzgénikus törzseket állítottak elő minden kromoszómára Előnyei: F1 szűrés létfontosságú gének szövetspecifikus fenotípusa tanulmányozható m leány kromatídák m G2 Flp rekombináz m M m m m Homozigóta mutáns klón Vad típusú iker klón

6 Domináns nősténysteril technika összefoglalása
P(ovoD) FRT FRT m X balanszer balanszer P(ovoD) m +Flp P(ovoD) m/m P(ovoD) Flp rekombináz m m P(ovoD) P(ovoD) m m m P(ovoD) Homozigóta mutáns ivarsejt klón iker klón elpusztul Nem rekombináns elpusztul

7 Szem-specifikus FLP/FRT technika összefoglalása
P(w+) P(w+) FRT Ikerfolt sötét piros P(w+) P(w+) Flp m m m Homozigóta klón fehér m P(w+) Nem rekombináns piros Szem-specifikus FLP expresszió m P(w+) FRT P(w+) M M M Ikerfolt elpusztul M P(w+) P(w+) Flp m m m Homozigóta klón fehér m P(w+) Nem rekombináns piros M Szem-specifikus FLP expresszió m

8 Példák mitótikus klónok analízisére
1 2 A Flp expresszió lárvákban 1. az imágókorongok növekedését és diferenciálódását nnérintő mutációk azonosítása tumoros növekedést okozó mutációk azonosítása tumorszupresszorok azonosítása 2. Integrin adhéziós komplex azonosítása Flp szövetspecifikus expressziója 3-4. Axon növekedési mintázat kialakulását szabályozó gének azonosítása 5. Méret szabályozásban szerepet játszó gének azonosítása 3 C 4 D 5 E

9 A P elem technikák: irányított génszupresszió
Génmanipuláció ecetmuslicában: P elem technikák A P elem technikák: irányított génszupresszió

10 RNS interferencia RNS interferencia (RNAi) egy evolúciósan konzerválódott védekezési mechanizmus Poszt-transzkripciós szinten hat Kettősszálú RNS szupresszálja a génexpressziót mRNS-ek szekvencia specifikus degradációján keresztül Egy reverz genetikai módszerré fejlődött a génfunkció tanulmányozására Gyógyászati felhasználása óriási lehetőségeket rejt magában és most van kibontakozóban

11 Az RNS interferencia mechanizmusa
Kettősszálú RNS indukálja a folyamatot Egy Rnáz III enzim (Dicer) kis, nukleotid hosszú RNS duplexeket (siRNA) hoz létre A kis RNS-ek fehérjékkel endonukleáz aktivitással rendelkező ribonukleoprotein komplexeket alkotnak (RISC). A RISC komplex a kis RNS-sel komplementer mRNS-hez kötődik A RISC komplex endonukleáza (Slicer) elhasítja a mRNS molekulát A mRNS által kódolt fehérje nem termelődik

12 A pWIZ RNS interferencia vektor felépítése
Hsp70 TATA SV40 term white intron2 5xUAS CCTAGGTGAGTT TTTGAAACTCAGCTAGC Avr II Nhe I SD hely SA hely 3’P 5’P white pWIZ Spe I ACTAGT Avr II CCTAGG Nhe I GCTAGC Xba I TCTAGA Spe I Xba I

13 Irányított génexpresszió a Gal4 moduláris rendszerben - 1
enhanszer gén Gal4 mini-white ori amp E B Gal4 5xUAS Duplaszálú „hairpin” RNS molekulák

14 white dsRNS-t expresszáló transzgénikus egyedek fenotípusa
white transzgén egy kópiában vad típus T1 T2 T3 white transzgén két kópiában white- T4 T3