A P elemek mobilitásának szabályozása

Az előadások a következő témára: "A P elemek mobilitásának szabályozása"— Előadás másolata:

1 A P elemek mobilitásának szabályozása
Génmanipuláció ecetmuslicában: P elem technikák A P elemek mobilitásának szabályozása

2 A P elemek mobilitásának szabályozása
Két szabályozási állapot létezik: az M és a P citotípusnak megfelelő. - kromoszómális és extra-kromoszómális faktorok P citotípusú állatokban a P elemek transzkripciósan szupresszált állapotban vannak: - transzkripciós szabályozás? - poszt-transzkripciós szabályozás? A szabályozási mechanizmus anyai hatást és anyai öröklődést mutat. A P elemek mobilitásának szabályozásában szerepe van az inszerciók genomikus pozícióinak is. A P elemek mobilitása szövetspecifikus. A szabályozási mechanizmus részletei nem ismertek.

3 P elem függő hibrid diszgenezis
Nőstény szülő M P normális normális M M M citotípusú P citotípusú Hím szülő diszgenikus normális P M citotípusú P citotípusú Csak M és P törzsek közötti keresztezés okoz hibrid diszgenezist, de csak akkor, ha a hím származik a P törzsből

4 A snw genetikai esszé a transzpozáz aktivitás kimutatására
X snw Tesztelő törzs snw X : snw sne sn+ +

5 A P citotípus meghatározásában kromoszómális és extra-kromoszómális faktorok is szerepet játszanak
P citotípusú anyai öröklődés M citotípusú anyai öröklődés X DS: 2.2 % DS: 99.8 % DS: 3.9 % DS: 99.5 % DS: 4.2 % DS: 40.4 % DS: 2.4 % G0 G1 G2 Pre-P DS: diszgenikus sterilitás

6 A P elem mobilitás szövetspecifitását alternatív RNS splicing biztosítja
ATG TGA TAA ORF 0 ORF 1 ORF 2 ORF 3 IR AUG UAA AAAA ivarsejt mRNS 87 kD transzpozáz AUG UGA AAAA szomatikus mRNS 66 kD represszor AUG UAA belső deléció AAAA deléciós mRNS 24 kD represszor

7 A P elemek mobilitásának szabályozása
Két szabályozási állapot létezik: az M és a P citotípusnak megfelelő. - kromoszómális és extra-kromoszómális faktorok P citotípusú állatokban a P elemek transzkripciósan szupresszált állapotban vannak: - transzkripciós szabályozás? - poszt-transzkripciós szabályozás? A szabályozási mechanizmus anyai hatást és anyai öröklődést mutat. A P elemek mobilitásának szabályozásában szerepe van az inszerciók genomikus pozícióinak is. A P elemek mobilitása szövetspecifikus. A szabályozási mechanizmus részletei nem ismertek.

8 P elem transzpozíció gátlásának molekuláris mechanizmusai
Transzkripciós Poszt-transzkripciós Tnp 66kD 66kD 66kD aktív Tnp inaktív Tnp

9 A P elemek mobilitásának szabályozása
Két szabályozási állapot létezik: az M és a P citotípusnak megfelelő. - kromoszómális és extra-kromoszómális faktorok P citotípusú állatokban a P elemek transzkripciósan szupresszált állapotban vannak: - transzkripciós szabályozás? - poszt-transzkripciós szabályozás? A szabályozási mechanizmus anyai hatást és anyai öröklődést mutat. A P elemek mobilitásának szabályozásában szerepe van az inszerciók genomikus pozícióinak is. A P elemek mobilitása szövetspecifikus. A szabályozási mechanizmus részletei nem ismertek.

10 A 66kDa represszor szerepe a P citotípus kialakításában
dajkasejtek petesejt follikuláris sejtek P elemek olyan genomikus régióba inszertálódnak, amelyek expresszálódnak az oogenezis folyamán. A 66 kDa represszor fehérje termelődik a dajka és follikuláris sejtekben az oogenezis folyamán. A petesejt felhalmozza a 66 kDa represszor fehérjét, ami gátolja a transzpozáz képződését és aktivitását. A 66 kDa represszor fehérje jelenléte biztosítja a P citotípus anyai hatását és anyai öröklődését.

11 A P elemek mobilitásának szabályozása
Két szabályozási állapot létezik: az M és a P citotípusnak megfelelő. A szabályozási mechanizmus anyai hatást és anyai öröklődést mutat. - kromoszómális és extra-kromoszómális faktorok P citotípusú állatokban a P elemek transzkripciósan szupresszált állapotban vannak: - transzkripciós szabályozás? - poszt-transzkripciós szabályozás? A P elemek mobilitásának szabályozásában szerepe van az inszerciók genomikus pozícióinak is. A P elemek mobilitása szövetspecifikus. A szabályozási mechanizmus részletei nem ismertek.

12 X P elem transzpozíció gátlásának „trans-silencing” modellje
Riporter P elem inszerció P elem inszerció TAS szekvencákban Csökkent riporter expresszió

13 A P elem technikák: mutagenezis I.
Génmanipuláció ecetmuslicában: P elem technikák A P elem technikák: mutagenezis I.

14 A P elem mutagenezis Először P citotípusú P törzsekkel és vad típusú P elemekkel Mutációk nem stabilak A mutánsok több inszerciót is hordoznak Körülményes a mutációk térképezése, és az érintett gének klónozása Mutagenezis egyetlen P elem felhasználásával A mutagenezis egy-egy speciális P elemet hordozó nőstény és hím keresztezése során játszódik le. Mutátor elemek (nem autonóm) Jumpstarter elemek (nem autonóm) Mutáns vonalak egyetlen random mutátor inszerciót hordoznak. Az érintett gének könnyen azonosíthatók és klónozhatók.

15 A P-lacW mutátor elem felépítése
lacZ mini-white ori amp E B Génexpresszió követését teszi lehetővé Marker gén lehetővé teszi a P elem követését Bakteriális szekvencia a DNS klónozást teszi lehetővé

16 P elemmel jelölt gének klónozása plazmid menekítési kísérletben
EcoRI A gén B gén C gén P elem inszerciósmutáns izolálása EcoRI A gén Genomikus DNS EcoRI emésztése majd ligálása ori amp EcoRI menekítő plazmid baktérium transzformáció és antibiotikum szelekció plazmid DNS izolálása és befogott gének azonosítása

17 Domináns P elem inszerciós mutánsok izolálása
P(w+) mutátor törzs transzpozáz forrás W- P(Δ2-3), Sb X Y TM6, Tb P(w+) P(w+) W- P(Δ2-3), Sb W- X Y W- „jump-starter” hímek Y W- P(w+) P(w+) W- vagy Y w- hímek szűrése domináns fenotípusra

18 Recesszív P elem inszerciós mutánsok izolálása
Y W- P(w+) W- Sco X W- SM5 F2 az előző keresztezésből Y W- P(w+) P(w+) W- X SM5 W- SM5 Szűrés recesszív látható, vagy letális mutációra