IN VITRO MUTAGENEZIS Buday László.

Az előadások a következő témára: "IN VITRO MUTAGENEZIS Buday László."— Előadás másolata:

1 IN VITRO MUTAGENEZIS Buday László

2 AZ IN VITRO MUTAGENEZIS LEHETSÉGES FORMÁI
A, regulátor régiók mutagenezise B, kódoló szekvenciák mutagenezise 1, deléciók 2, inzerciók 3, szubsztitúciók 4, pont mutációk 5, hely specifikus mutációk (v. site-directed mutagenesis v. oligonukleotid-irányította mutagenezes) 6, random-mutagenezis

3 DELÉCIÓK I. Fragmentum kivágása restrikciós endonukleázzal. DNS EcoRI EcoRI ligálás mutált DNS

4 DELÉCIÓK II. Deléciók készítése BAL 31 exonukleázzal: BAL 31 exonukleáz tulajdonságai: 1, 3’ 5’ exonukleáz aktivitás: mononukleotidok eltávolítása dupla szálú DNS-ről 2, 5’ 3’ exonukleáz aktivitás: mononukleotidok eltávolítása egy- 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ exonukleáz aktivitás 5’ 3’ 3’ 5’

5 EMÉSZTÉS BAL 31 EXONUKLEÁZZAL

6 Klasszikus site-directed mutagenezis elve
mutációt hordozó oligonukleotid egyszálú DNS DNS polimeráz megszintetizálja a komplementer láncot az oligonukleotid, mint primer felhasználásával ligálás + bakteriális transzformáció mutáns plazmid vad plazmid

7 Klasszikus site-directed mutagenezis lépései
1, Oligonukleotid tervezése és szintézise 2, Oligonukleotid hibridizációja az egyszálú DNS plazmidhoz 3, A komplementer DNS lánc szintézise az oligonukleotid primer és DNS polimeráz felhasználásával a 4 dNTP felhasználásával 4, Az új DNS lánc „körösítése” DNS ligáz segítségével 5, Kompetens baktériumok transzfekciója 6, A mutáns plazmidot hordozó baktérium-telepek azonosítása 7, A mutáns DNS izolálása a baktériumokból (miniprep) 8, A mutáns DNS megerősítése DNS szekvenálás segítségével

8 PCR ALAPÚ MUTAGENEZIS Egyszerű esetben: 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ mutáns
primer 3’ 5’ 3’ 5’ primer 3’ 5’ 3’ 5’ mutáns PCR termék

9 Bonyolultabb esetben:
primer II. 3’ 5’ 3’ 5’ primer I. Ide szeretnénk mutációt betenni Mit lehet tenni?

10 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ MEGOLDÁS: MEGPRIMER MÓDSZER primer III.
I. PCR reakció Hibridizáltatjuk az eredeti DNS-t az új PCR termékekkel 5’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’

11 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ megaprimer primer III. II. PCR reakció
végleges mutáns PCR termék

12 „ADD-ON” MUTAGENEZIS 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ primer II. primer I.
primer IV. primer II. 5’ 3’ 3’ 5’ primer I. primer III.

13 5’ 3’ 5’ 3’ PCR-A PCR-B 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ primer IV. primer II.
primer III. PCR-A PCR-B 5’ 3’ 3’ 5’ PCR termékek denaturációja, majd összekeverése 5’ 3’ 3’ 5’

14 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ végek extenziója
vagy 5’ 3’ 3’ 5’ 3. PCR reakció primer I és II-vel primer II. 5’ 3’ 3’ 5’ primer I.

15 TETSZŐLEGES GÉNSZAKASZ AMPLIFIKÁCIÓJA
PCR SEGÍTSÉGÉVEL 5’ 3’ DNS 3’ 5’ Ezt a génszakaszt szeretnénk amplifikálni és utána egy adott vektorba ligálni. Milyen primereket tervezzünk? primer II. 5’ 3’ ? 3’ 5’ primer I.

16 Resrtrikciós enzim hasítási helyeket kell elhelyezni a primerekben.
pl. BamH1 5’ 3’ 3’ 5’ pl. EcoRI PCR reakció BamH1 EcoRI PCR termék a tervezett restrikciós enzim hasítási helyekkel

17 A tervezett primerek 5’ végének egyáltalán nem kell illeszkedni
a komplementer DNS szálhoz BamH1 5’ 3’ 5’ EcoRI PCR reakció lehet epitop-cimkét kódoló DNS szakasz PCR termék, mely tartalmaz egy epitop-cimkét és két restrikciós endonukleáz hasítási helyet.

18 „UNIQUE SITE ELIMINATION” MÓDSZER (Amesrham-Pharmacia)

19 „QUICKCHANGE” MÓDSZER
(Stratagene)

20

21 „GeneEditor” MÓDSZER (Promega)

22 RANDOM MUTAGENEZIS FORMÁI
1, Kémiai mutagenezis 2, „Kazetta” mutagenezis 3, „Misinkorporációs” mutagenezis

23 -- a random mutagenezis legjobb hatásfokú fajtája
KÉMIAI MUTAGENEZIS -- a random mutagenezis legjobb hatásfokú fajtája -- általában max. 200 bp mutagenezisére használják -- kémiai mutagénekkel kezelik a dupla szálú DNS-t, ilyenek: hidroxilamin, salétromossav, biszulfit, hidrazin, hangyasav, kálium-permanganát pl. hidroxilamin dezaminálja a citozint uracil keletkezik biszulfit dezaminálja a citozint uracil keletkezik hidrazin elhasítja a citozin és timin heterociklusos gyűrűit, ami végül a pirimidin nukleotidok elvesztéséhez vezet. A DNS replikáció során az „ilyen” nukleotiddal szemben bármelyik 4 nukleotid beépülhet -- sajnos a kémiai mutagenezis hatásfoka nagyon alacsony

24 „MISINKORPORÁCIÓS” MUTAGENEZIS
-- in vitro DNS szintézisnél a 4 nukleotid közül az egyikből nagyon keveset teszünk a reakcióelegybe -- az „éhező” DNS polimeráz ezért a másik három nukleotidból fog beépíteni a hiányzó helyére -- a DNS polimeráznak rossz vagy hiányos hibajavító képességűnek kell lennie, pl. Klenow-fragment vagy Taq polimeráz