Gyógyszerként használt fehérjék előállítása

Az előadások a következő témára: "Gyógyszerként használt fehérjék előállítása"— Előadás másolata:

1 Gyógyszerként használt fehérjék előállítása
Rekombinans DNS technológia

2 Fehérjék felhasználásának célja:
hiányzó vagy funkcióképtelen fehérje helyettesítése betegség diagnózisa vakcinálás: védekezőképesség fokozása Fehérjék előállításának módjai: tisztítás állati szervből tisztítás ember szervéből, vérből in vitro fehérjeszintézis rekombinans DNS technológia baktériumok vagy eukariota sejtkultúra felhasználásával Fehérjetisztítás lépései: sejtfeltárás, összetörés ultracentrifugálással sejtorganellumok elválasztása gélszűrés: méret szerinti elválasztás ioncserélő kromatográfia: töltés szerinti elválasztás affinitáskromatográfia: specifikus kölcsönhatás alapján elválasztás

3 A tisztított fehérje tisztaságának vizsgálata
poliakrilamid gélelektroforézissel (PAGE) Veszélyek: szennyezés a beteg számára idegen, a fehérjeforrásból (másik egyedből, fajból) származó fehérjékkel, melyek antigénként immunválaszt produkálnak szennyezés vírussal (pl. Hepatitis B vírus a vérkészítményekben) szennyezés prionnal (hypophysisből származó növekedési hormon) DNS felhasználása: helyettesítésre: génterápia egyedek azonosítása pl. Alu szekvenciával (bírósági perekben is) detektálás: vírusok, baktériumok, daganatos sejtek jelenléte örökletes megbetegedések prenatalis vagy postnatalis diagnózisa az evolúció kutatása, kihalt lények vizsgálata RNS használata antiszenz RNS a rossz, vagy feleslegben levő gén ellen

4 Gyógyászatban használt tisztított fehérjék
albumin heparin antitrombin pancreas emésztő enzimek urokináz sztreptokináz tripszin egyes hormonok Szintetizált peptidek oxytocin 9 octreotid 8 (szomatosztatin analóg) tetracosactid 24(ACTH 39 analóg) calcitonin 32 (lazac) vazopressin 8 és analógjai

5 A rekombinans géntechnológiában használt kifejezések magyarázata
rekombináns DNS: eredetileg ott nem levő DNS darabot tartalmazó DNS (másik kromoszómából, másik egyedből, másik fajból = kiméra) DNS denaturálása = megolvadása = egyszálúvá tétele: hővel (90 C), lúggal hibridizáció = renaturálás = reasszociáció = kétszálúvá tétel: komplementer bázisok hidrogén-hidat képeznek DNS hasítása: restrikciós endonukleázzal bizonyos szekvenciákra specifikus helyen nukleinsav fragmensek szétválasztása nagyság szerint: gélelektroforézissel (agar, PAGE), a sok foszfát negatív töltésűvé teszi a nukleinsavakat nukleinsavak láthatóvá tétele gélen: beépített 32P-izotóp → béta-bomlás → fotoemulzión autoradiográfia beékelődő etidium-bromid → UV-fény → fluoreszkálás DNS-fragmens sokszorozása PCR = polymerase chain reaction klónozás vektor segítségével baktériumban, gombában, sejttenyészetben

6 DNS-fragmensek szekvenálása = bázissorrrend meghatározása:
1.) különböző bázisok mellett specifikusan, kémiai ágenssel történő hasítással = Maxam-Glilbert kémiai módszere 2.) komplementer lánc megszakított enzimatikus szintézisével = Sanger didezoxiribonukleotidos módszere II. típusú restrikciós endonukleáz: baktériumok által termelt, a genomjukba beépülő idegen, virális DNS-t kimetszeni tudó, ezért a vírusok szaporodását gátló, a DNS-t specifikus helyen, valahol a láncon belül hidrolizáló enzim. 4-8 bázispár hosszú nem metilált palindrom szekvenciát ismernek fel, ezen belül hasítanak, vagy mindkét szálon azonos helyen hasítva tompa véget, vagy a két szálon különböző helyen hasítva ragadós véget létrehozva. Az azonos szekvenciát felismerő metiláz a saját DNS-t közvetlenül osztódás után metilálja. vektor: rekombináns DNS-t tartalmazó, a gazdasejtben szaporodni tudó hordozó

7 plazmid: kis, cirkuláris, extrakromoszomális, baktériumban önállóan szaporodó,
antibiotikum-rezisztenciát vagy sex-faktort hordozó DNS bakteriofág: baktériumban szaporodó vírus klón: egy őstől származó, egy sejtből eredő, ezért azonos genetikai információt hordozó populáció próba: radioaktívan erősen jelzett, mesterségesen előállított, ismert bázissorrendű 10-20-nukleotidnyi egyszálú DNS vagy RNS, mely hibridizálni fog a keresett nukleotidfragmens egy részletével blottolás: gélről nitrocellulózra, nylonra, stb. elektromos térben átvitt néhány molekula, mely az új hordozón kimutatható, azonosítható, a blottolás megismételhető, a kimutatott molekula eredeti pozíciója a gélen vissza- kereshető DNS-könyvtárak: a.) genomiális: az egyed (pl. humán) teljes kromoszómaállományát feldarabolva, külön klónokban tartalmazó baktériumok tenyészete b.) complementer: egy sejt messenger RNS-állományáról kettősszálú DNS-sé visszaírt DNS-fragmenseket tartalmazó baktériumtenyészete

8 PCR animation

9 PCR: minden ciklusban duplikálódik a DNS-fragmentum

10 Construction of complementer DNA library
az egyedre, egy szövetére, adott fejlettségére jellemző mRNS-ek összessége, mely a sejtre jellemző arányban tartalmazza az ott expresszálódó fehérjék mRNS-eit, intronok, reguláló szekvenciák stb. nélkül

11 Construction of genomic DNA library using bacteriophage
A genomiális DNS-könyvtár az élőlény összes kromoszómájának minden részét tartalmazza átfedő szekvenciákkal, mert a hasítás nem minden lehetséges helyen történt meg 50000 kolónia/petricsésze tenyésztés táptalajon 20-30 petricsésze/humán genom

12 Clone selection by probe and autoradiography

13 Kisebb genomú élőlények vagy cDNS-könyvtár létrehozása plazmiddal

14 DNA sequencing by Sanger-method: interrupted synthesis of complementer strand

15 DNA sequencing by Sanger-method: interrupted synthesis of complementer strand

16 DNA sequencing by Maxam – Gilbert method: specific cleavage by chemicals

17 DNA sequencing by Maxam-Gilbert method: detection by gel electrophoresis

18

19 Protein (G-CSF) synthesis by bacterial expression vector

20 Synthesis of insulin by bacterial expression vector

21 A fehérjék előállítására használt, plazmidot tartalmazó bakteriális expressziós vektornak tartalmaznia kell: ori régió: a DNS-replikáció kezdőpontja polilinker régió: több hasítási hely a beilleszteni kívánt idegen DNS-darab számára, megfelelő restrikciós endonukleázok felismerő helyeivel szelekciós marker: a plazmid jelenlétét bizonyító antibiotikumrezisztencia-gén szabályozó régió: a beilleszteni kívánt gén előtt, a promoter régió a gazdasejt, vagyis a baktérium számára megfelelően szabályozza a génátírást pl. az Escherichia coli számára a béta-galaktozidáz promotere

22 Recombinant DNA technology products
Proteins and their indication of usage: Insulins – diabetes mellitus STH = GH = somatotroph hormon = growth h. - dwarfism erythropoetin – anaemia because of renal failure interferon – leukemia molgramostin = granulocyte-macrophage stimulatory factor – immun deficiency tPA = tissue type plasminogen activator – thrombolysis Hepatitis B virus antigen – active immunization Blood clotting factor VIII - hemophilia Genes: CFTR = cystic fibrosis transmembrane regulatory protein = chloride channel in epithelial cells ADA = adenosine deaminase