Boros Imre tanszékvezető egyetemi tanár

Az előadások a következő témára: "Boros Imre tanszékvezető egyetemi tanár"— Előadás másolata:

1 Boros Imre tanszékvezető egyetemi tanár
MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA 2 PROTEIN SORTING I. Boros Imre tanszékvezető egyetemi tanár

2 Egy funkcióképes fehérje képződéséhez vezető lépések:
A nascens polipeptid lánc szintézise Folding és kofaktor kötés (nem kovalensen kapcsolódó faktor(ok) kapcsolódása) Kovalens módosítások (több mint 100 féle módosítás ismert !) Kapcsolódás más alegységekkel FOLDING:

3 A fehérje térszerkezet kialakulása - folding
Szintézisüket követően a fehérje domének először egy „olvadt gömbszerű” (molten globule) térszerkezetet vesznek fel, majd egy sokkal lassab folyamattal, többféle útvonalon, chaperon (dajka) fehérjék közreműködésével kialakul a funkciójukat biztosító helyes térszerkezet. A helytelen térszerkezetet kialakított fehérjéket javító mechanizmusok kitekerik és újra lejátszódhat a folding, vagy a fehérje lebontásra kerül.

4 A polipedtid láncok térszerkezete a szintézist követően a szerkezeti és funkcionális önállósággal rendelkező részletenként – doménenként – alakul ki.

5 A folding elősegítői a chaperonak
A hsp70 (70 kDa tömegű hősokk fehérje) a szintetizálódó polipeptid láncon kapcsolódik a hibrofób felületekhez és megakadályozza, hogy a hidrofób részek közötti kölcsönhatások a képződő fehérje láncot rossz konformációban rögzítsék. APT-t hidrolizálva a hsp70 megváltoztatja konformációját, aminek hatására módosul kapcsolódása a fehérjéhez is és ezzel módosítja kismértékben annak szerkezetét is. A hsp70 és más hsp fehérjék disszocióciója és asszociációja végeredményben segíti a helyes – energetikailag stabil – konformáció kialakulását.

6 Egy átlagos állati sejtben különböző féle fehérje molekulából összesen kb 1010 db található. A fehérjék szintézise a citoplazmában történik, de funkciójukat különböző kompartmentekben fejtik ki. A kompartmentek elszeparálása állandó, vagy időszakosan megszünhet: a mitokondrium membrán mindig ép, de a sejtmagot és citoplazmát elválasztó határ sejtosztódáskor megszünik Kiterjedt import és export folyamatok működnek a fehérjék (és egyéb komponensek) transzportjára, ami egyes fehérjék életében csak egy alkalommal, más fehérjék esetében ismételten, többször is megvalósul.

7 A sejten belüli fehérje transzport fő útvonalai és mechanizmusai:
A transzport mechanizmusai: Gated transport: szelektív kapukon át, pl.citoplazma-sejtmag Transmembrane transport: membránba ápült transzlokátorokkal, a fehérje rendszerint unfolded állapotban, kígyószerűen, pl. citoszolból az ER-be vagy mitokondriumba, Vesicular transport: membránnal körülvett kis csomagokban, a vezikulum lefűződik az egyik kompartmentről és fúzionál egy másikkal tartalmát egyikből a másikba átvíve, pl. ER-ből a Golgi-ba címzések (sorting signals) a fehérje aminosav sorrendben

8 Szignál szekvenciák Színes: bizonyítottan fontos a jelenléte, piros: pozitívan töltött, zöld:negatívan töltött, sárga: hidrofób, kék: hidroxilált, H3N: amino terminális, COO karboxi terminális vég

9 A fehérje transzlokációt biztosító cimzések meghatározásában a rövid szignál szekvenciát alkotó aminosavak minősége, sorrendje és a belőlük kialakuló peptid rész térszerkezete egyaránt szerepet játszik. Pl. a cytokrom oxidáz IV. alegységének mitokondriumba szállítását egy 18 aminosavból álló szignál peptid rész biztosítja. Amikor ez a peptid rész felveszi az alfa-hélix szerkezetet a pozitivan töltött (piros) aminosav részek a hélix egyik oldala az apoláros aminosav maradékok (sárga) a hélix másik oldala felé fordulnak. Ez a sajátosság a mitokondrium matrixba történő fehérje transzportot biztosító szignálokra általában jellemző.

10 FEHÉRJE TRANSZPORT VIZSGÁLATRA ALKALMAZOTT MÓDSZEREK
In vitro DNS rekombinációval előállított génben szignál szekvencia kapcsolható a kódoló részhez, majd transzfekció után pl. immunfestéssel vizsgálható a képződött fehérje elhelyezkedését a sejtben. Megállapítható, hogy milyen aminosavak fontosak a szignál szekvenciában. In vitro fehérje szintetizáló rendszerben radioaktívan jelzett fehérje előállítható, majd sejtkivonattal összehozva megállapítható transzportálódik-e a fehérje organumba és ha igen milyen körülmények között (pl. ATP igény)

11 FEHÉRJE TRANSZPORT VIZSGÁLATRA ALKALMAZOTT MÓDSZEREK 2
A fehérje transzportját egy organellumba jelezheti, hogy ha az organellum membrán ép az megvédi a a fehérjét proteázok hasításával szemben, de ha detergenssel az organellum membránt megbontjuk a fehérje degradálható. A radioaktív formában előállított fehérjét az organellumot tartalmazó és nem tartalmazó sejtkivonattal inkubálva megállapítható levágódik-e a szignál a transzport során

12 TRANSZPORT A CITOPLAZMA ÉS SEJTMAG KÖZÖTT
Sejtmag membrán (nuclear envelope) Belső és külső membrán, perinukleáris tér, nukleáris lamina, nukleáris polusok Folyamatos transzport: Import: hisztonok transzkripció, replikáció, stb fehérjéi (a DNS szintézis időszakában kb 106 hiszton molekula importja 3 percenként) Export: mRNS-ek, tRNS, stb (riboszóma fehérjék import a citoplazmából magba, ott összeszerelődés, majd alegység export vissza a citoplazmába)

13 Nuclear pore complex: Mw: 125 MDa 50 kölönböző nukleoporin fehérje, komlex/sejtmag (percenként 100 hiszton molekula importja porusonként) Kis molekulákra az áteresztő képessége olyan mintha egy 9 nm átmérőjű vizzel töltött cső lenne (átjutás: < 5000 d szabadon, < d lassan, < d nincs (RNS polimeráz alegységek d, riboszóma alegység: 30 nm))

14 TRANSZPORT A CITOPLAZMA ÉS SEJTMAG KÖZÖTT
IMPORT: Sejtmagi lokalizációs szignál (NLS, nuclear localization signal) :pozitivan töltött aminosavakban (lizin, arginin) gazdag folyamatos, vagy megszakítottan több rövid szekvencia részlet, amely a fehérje felszinén helyezkedik el Nukleáris import receptors (importinok): citoplazmatikus fehérjék, amelyek kötődnek a transzportra kerülő fehérjéhez (cargo) és a nukleoporinokhoz, az NLS típusától függően rokon szerkezetű, de kölönböző receptorok, egyes esetekben kapcsolódás a cargóhoz adaptor fehérjén át FG-ismétlődések: (fenilalanin-glicin) repeatek: a pore complex fibrillumait alkotó nukleoporinokban, ezekhez kötödve –disszociálva – újra kötődve biztosítja a receptor a transzportot EXPORT: Nukleáris export szignáls Nukleáris export receptors – karyopherynek A kétirányú transzport hasonló molekulák résztvételével, egyazon poruson át mindkét irányban zajlik

15 A transzportnak iránya van, eredményekén a rendezettség nő, egyes fehérjék koncentrációja nő a sejtmagban (citoplazmában) : energia befektetés szükséges Ran: GTP-hasító fehérje – (GTPáz) egy molekuláris kapcsoló Két lehetséges állapota: Ran-GTP és Ran-GDP GAP: GTPáz aktiváló fehérje : a citoplazmában: RanGTP → RanGDP RBP: Ran-kötő fehérje, a citoplazmában GEF: guanin nukleotid kicserélő faktor: a sejtmagban a kromatinhoz kötődve RanGDP → RanGTP

16 A magban Ran-GDP disszociáció Ran-GTP kötés a receptorhoz
A citoplazmában: RBP hatására Ran-GTP disszociáció a receptortól, GTP hidrolízis A két állapotú Ran fehérje gradiense a mag és a citoplazma között biztosítja a transzport irányítottságát Ki-be járó fehérjék transzportjának szabályozása: a szignál szekvenzciák módosításával, maszkirozásával, a fehérje kipányvázásával MITÓZISKOR A laminok foszforilálódnak, a nukleáris lamina depolimerizál, magmembrán feldarabolódik az ER-rel fúzionál, a porus komplexek alegységeikre disszociálnak – a magi és citoplazmatikus fehérjék elkeverednek Anafázisban: a laminok defoszforilálódnak és kapcsolódnak a kromatinhoz …

17

18 FEHÉRJE TRANSZPORT A MITOKONDRIUMBA és PLASZTISZBA
(külső és belső membrán, membránok közötti tér és mátrix) Az organellumok fehérjéinek döntő többsége a citoplazmában szintetizálódik és a transzláció befejeződését követően transzportálódik az organellumba. A transzportot biztosító szignál rendszerint a fehérje N- terminális része, amit a transzportot követően a szignál peptidáz levág.

19 FEHÉRJE TRANSZPORT A MITOKONDRIUMBA és PLASZTISZBA
A mitokondriumba irányuló proten transzport megvalósítói a TOM (translocase of the outer membrane) és TIM (… inner …) és az OXA complexek A komplexek tartalmazzák a szignál szekvenciát megkötő fehérjéket és a transzlokációs csatornát kialakító fehérjéket TOM: minden mitokondriumba irányuló protein transzportjához kell. Transzport a külső membránon át és külső membránba illesztés. TIM: transzport a matrixba és belső membránba illesztés OXA: a mitokondriumban szintetizálódott fehérjék beillesztése a belső membránba

20 A TOM és TIM komplex a két mitokondrium membrán érintkezési pontjainál tartósan együtt fordulnak elő és a transzport a matrixba egy folyamatban zajlik A mitokndriumba kerülő fehérjék foldingja nem játszódik le szintézisüket követően, hanem Hsp70 chaperonokkal kapcsolódva kitekeredett állapotban maradnak. A transzport előtt ATP hidrolízissel összekapcsolva a Hsp70 disszociál a fehérjéről, majd a mitokondrium matrixba jutott részhez a mitokondrium Hsp70 kapcsolódik ismét. A transzporthoz szükséges energiát részben az ATP hidrolízis, részben a belső membrán két oldala között fennálló elektrokémiai proton gradiens biztosítja.

21 A transzportált fehérjét a mitokondrium Hsp70 mintegy áthúzza a membránon:
mtHsp70 erősen kötődik a kitekeredett fehérje hidrofób részeihez, majd ATP hidrolízissel disszociál. Az ismételt kötődés-disszociáció ciklusok végeredményben a teljes szállított polipepdtid lánc átjutását eredményezik. A mátrixban a mtHsp60 közreműködésével kialakul a fehérje helyes térszerkezete.

22 Fehérje transzport peroxiszómákba
Peroxiszómák: egyszeres membránnal körülvett oxidativ enzimeket (kataláz, utátoxidáz) tartalmazó vezikulomok, minden alkotó proteinjük a citoplazmában szintetizálódik. Enzimek amelyek molekuláris oxigént használnak hidrogén eltávolítására valamilyen szerves molekuláról: RH O R + H2O2 Mérgező anyagok oxidációja a hidrogénperoxid felhasználásával (kataláz) Zsirsavak beta-oxidációja A fehérje transzport: szignálja három aminosav a C-terminálison (Ser-Lys-Leu) a transzport ATP-igényel, a transzportált fehérje natív, feltekeredett állapotban kerül átszállításra peroxinok : citoplazmatikus receptorok és dokkoló fehérjék a membránban Zellweger szindróma: üres peroxiszómák a szállításban résztvevő egyik peroxin gén (pex2) mutációja miatt