Mikronalalitikai kurzus szubsztrátkönyvtár

Az előadások a következő témára: "Mikronalalitikai kurzus szubsztrátkönyvtár"— Előadás másolata:

1 Mikronalalitikai kurzus szubsztrátkönyvtár
Szerin proteinázok specificitás vizsgálata kompetitív oligopeptid szubsztrát rendszer fordított fázisú HPLC analízisével.

2 Schechter-Berger nómenklatúra
Mikronalalitikai kurzus szubsztrátkönyvtár Schechter-Berger nómenklatúra P4’ Enzim S5 S3 S1 S2 S1’ S2’ S6 P5 P3 P2 P2’ P1’ P6 P1 Hasadó kötés N C S3’ S4’ S4 P4 P3’ Szubsztrát  , P1-P1’ kötés: a hasadó kötés; P6-P4’: szubsztrát hatóhelyek; S6-S4’: a P6-P3’ helyeknek megfelelő enzim hatóhelyek; P6-P1: a szubsztrát savkomponense (N-terminális rész); P1’-P4’: a szubsztrát aminkomponense (C-terminális rész); S1: az elsődleges specificitást meghatározó hely; P1: az S1 helyet elfoglaló szubsztrát alegység.

3 S1A proteinázok kötőfelszínei
Mikronalalitikai kurzus szubsztrátkönyvtár S1A proteinázok kötőfelszínei Katalitikus triád S2 helyek S’ helyek N-terminális domén C-terminális domén S4 helyek S1 helyek 189. pozíció

4 Hatóhely preferenciák
Mikronalalitikai kurzus szubsztrátkönyvtár Hatóhely preferenciák S1A tagok általában P4 P3 P2 P1 P1’ P2’ Szerpin statisztika Ali.Hfb Ali.Hfb/T Hfb/P - S Kompetitív/kvázi kompetitív kísérletek adatai Hfb S/Kis Hfb Acil-transzfer kísérletek adatai Peptid szubsztrát hasítóhelyek X Szerkezeti adatok Hfb/+ „Konszenzus” S/Hfb Tripszin Kimotripszin P4 P3 P2 P1 P1’ P2’ Szerpinek A I P - S T L Kompetitív/kvázi kompetitív kísérletek adatai G Aro. Hfb Ali. Acil-transzfer kísérletek adatai M R Peptid szubsztrát hasítóhelyek N S/A Kis Y/T R/T T/A Szerkezeti adatok Ali.Hfb X Ali. Hfb + „Konszenzus” Hfb/ Hfb / S +/S Hfb: hidrofób; Kis Hfb: kis hidrofób Ali.Hfb: alifás hidrofób; Aro.Hfb: aromás hidrofób +: pozitív töltésű

5 Optimális közös peptidgerinc tervezése. Megfontolások
Mikronalalitikai kurzus szubsztrátkönyvtár Optimális közös peptidgerinc tervezése. Megfontolások Alapkövetelmények: S–P és S’–P’ kölcsönhatások kialakítása Kompetitív reakcióelrendezés

6 Optimális közös peptidgerinc tervezése. Megfontolások
Mikronalalitikai kurzus szubsztrátkönyvtár Optimális közös peptidgerinc tervezése. Megfontolások S–P és S’–P’ kölcsönhatások kialakítása A P’ kölcsönhatások hiánya miatt a kromogén szubsztrátok nem jöhetnek szóba. ↓ Az S1A enzim-szubsztrát kölcsönhatásokban általában szükséges és elégséges P4–P2’ távolságot átfogó oligopeptid szubsztrát Kompetitív reakcióelrendezés ↓ Olyan oligopeptidek keveréke, melyek azonos aminosavakat hordozó „gerinccel” rendelkeznek, és csak a hasítóhelyen (P1 pozíció) tartalmazzák a vizsgálandó specificitásoknak megfelelő aminosav oldalláncokat

7 Optimális közös peptidgerinc tervezése. Megfontolások
Mikronalalitikai kurzus szubsztrátkönyvtár Optimális közös peptidgerinc tervezése. Megfontolások Analitikai módszer: Optikai detektálás Egyéb módszerek (HPLC, fehérje-szekvenálás, MS)

8 Optimális közös peptidgerinc tervezése. Megfontolások
Mikronalalitikai kurzus szubsztrátkönyvtár Optimális közös peptidgerinc tervezése. Megfontolások Optikai detektálás Egy lépéses egyszerű jelöléses vagy IFQ detektáláshoz egyelőre nem áll rendelkezésre kellő számú különböző csoport. ↓ Azonos jelölőcsoportot, vagy IFQ csoport párt tartalmazó szubsztrátok Az enzimatikus hasítás csak a komponensek elválasztása után lenne követhető. Egyéb módszerek Fehérjeszekvenálás: a reakcióelegy „pool” szekvenálása több analitikai buktatót is rejt. ↓ Megelőző analitikai HPLC Egyéb módszerek HPLC: a jelölt oligopeptidek alkalmazásához képest csökkent érzékenység ↓ A reakcióidő növelése

9 Optimális közös peptidgerinc tervezése. Megfontolások
Mikronalalitikai kurzus szubsztrátkönyvtár Optimális közös peptidgerinc tervezése. Megfontolások P1 pozícióban a két archetípust, a tripszin és kimotripszin specificitást reprezentáló oldalláncok: Arg, Lys, Trp, Phe, Tyr és Leu P1 pozícióban a HPLC elválasztás belső standardjaként az egyik komponens tartalmazzon inert aminosavat: Pro-t A közös szekvencia egyformán elfogadható vagy elfogadhatatlan mindkét archetípus és várhatóan a belőlük származtatható mutánsok, általában S1A proteinázok számára. P1’ pozícióban nem tartalmazhatnak a szerin proteináz hidrolízisben kedvezőtlen, „tiltott” aminosavakat: prolint, savas oldalláncot. A közös szekvencia aminosavai nem szolgálhatnak jó hasítási helyként szerin proteinázok számára. Az oligopeptideknek oldhatóaknak kell lenniük fiziológiás körülmények között, nem tartalmazhatnak az oldódást gátló hidrofób „magot” lehetőleg tartalmazzanak az oldódást megkönnyítő hidrofil oldalláncokat. A peptidszekvenciákban ne legyenek olyan savas vagy bázikus „magok”, melyek a pH helyi megváltoztatása révén befolyásolhatják az enzimreakció lefolyását. Kerülendő olyan aminosavak beépítése, melyek problémát okozhatnak a szintézis vagy a tisztítási lépések során.

10 Optimális közös peptidgerinc tervezése A közös P4-P2’ mag tervezése
Mikronalalitikai kurzus szubsztrátkönyvtár Optimális közös peptidgerinc tervezése A közös P4-P2’ mag tervezése P1 pozíció: Arg, Lys, Trp, Phe, Tyr, Leu és Pro P2 pozíció: hatóhely preferenciák konszenzusa alapján, illeszkedve a klasszikus kromogén szubsztrátokhoz: Pro P3 pozíció: hatóhely preferenciák konszenzusa alapján, illeszkedve a klasszikus kromogén szubsztrátokhoz: kis hidrofób: Ala P4 pozíció: hatóhely preferenciák konszenzusa alapján, illeszkedve a klasszikus kromogén szubsztrátokhoz: kis hidrofób: Ala P1’ pozíció: hatóhely preferenciák konszenzusa alapján, átlagosan elfogadott: Ser P2’ pozíció: hatóhely preferenciák konszenzusa alapján kis hidrofób: Ala

11 Retenciós idő becslés Tr= B+AS Dini
Mikronalalitikai kurzus szubsztrátkönyvtár Retenciós idő becslés A peptidkeverék komponensek retenciós időinek becslésére a következő képletet használtuk Tr= B+AS Dini   Ahol Tr a retenciós idő, Di: i aminosav oldallánc hozzájárulása a peptid retenciójához, ni: i aminosav száma a peptidben, A és B: a kromatográfiás rendszerre az oszlop, holttérfogatok, gradiens, és az eluensek által meghatározott állandók. Aminosav Gly Ala Val Ile Leu Phe Tyr Trp Met Pro D 4,0 2,4 7,4 27,4 26,4 31,4 21,0 35,8 14,5 7,9 Ser Thr His Arg Lys Asp Glu Asn Gln 1,1 7,8 0,0 -3,1 -0,1 2,7 3,2

12 Rekker retenciós idő (TRr)
Mikronalalitikai kurzus szubsztrátkönyvtár Optimális közös peptidgerinc tervezése. A komponensek RP-HPLC elválasztásának hangolása. Retenciós idő hangoló tagok bevitele A magszekvencia retenciós viszonyai 1. N AAPX 9,6 12,7 20,6 33,7 39,1 44,1 48,5 T AAPXSA 13,1 16,1 24,1 37,2 42,6 47,6 52 C SA 3,5 Analitikai célú bővítés 2. N HAAPX 18,4 21,5 29,4 42,5 47,9 52,9 57,3 T HAAPXSA 21,9 25,0 32,9 46,0 51,4 56,4 60,8 C SA 3,5 lépés peptid Rekker retenciós idő (TRr) ha X K R P Y L F W 5. N HAAPX 18,4 21,5 29,4 42,5 47,9 52,9 57,3 T HAAPXSADIQIDI 107,1 110,2 118,1 131,2 136,6 141,6 146 C SADIQIDI 88,7 4. N HAAPX 18,4 21,5 29,4 42,5 47,9 52,9 57,3 T HAAPXSADIQI 79,8 82,9 90,8 104 109,3 114 119 C SADIQI 61,4 3. N HAAPX 18,4 21,5 29,4 42,5 47,9 52,9 57,3 T HAAPXSADI 49,2 52,3 60,2 73,3 78,7 83,7 88,1 C SADI 30,8

13 RP-HPLC körülmények beállítása
Mikronalalitikai kurzus szubsztrátkönyvtár RP-HPLC körülmények beállítása Lehetséges adattartományok: A teljes szeparációs tartományt kihasználva adatgyűjtést végzünk az N-, és C-terminális peptidek és az intakt szubsztrátok retenciós tartományában. Az adatgyűjtést csak az N-, és C-terminális peptidek retenciós tartományában végezzük. Csak a C-terminális és az intakt peptidek retenciós tartományában gyűjtünk adatokat. Elválasztási körülmények Oszlop: Aquapore OD 300 (2,1 x 220mm) Áramlási sebesség: 300 ml/perc Injektálási térfogat: 5 ml Detektálás: 220 nm, 0,05 Full Scale A gradiens elúció sarokpontjai: Idő [perc] Összetétel [%B] Ekvilibrálás -12-0 23-23 Injektálás 23 Elválasztás 0-5 5-31 23- 35 Mosás 31-35

14 Az enzimatikus emésztések reakciókörülményei
Mikronalalitikai kurzus szubsztrátkönyvtár Az enzimatikus emésztések reakciókörülményei A enzimreakciókat nyolc különböző enzimmel (szarvasmarha tripszin, kimotripszin, plazmin és trombin, egér endoproteináz Arg-C, patkány kimotripszin és mutáns tripszin (Tyrpszin), kecskerák tripszin) végeztük. Az enzimkoncentrációkat úgy optimalizáltuk, hogy összehasonlítható, közel azonos reakciósebességet eredményezzen a különféle enzimekkel végzett emésztésekben. A szubsztrátkeverék komponensek ekvimoláris elegyét a reakciópufferben (0,05 M TRIS-HCl, 18 mM CaCl2) oldott egyedi oligopeptidek 1 mg/ml koncentrációjú törzsoldataiból készítettük. A reakciókat 30 ml optimalizált koncentrációjú enzimoldat 670 ml szubsztrátkeverék-oldatba való pipettázásával indítottuk és 25 oC-on, 8-as pH-n vezettük le. Az emésztéseket különböző reakcióidőknél (0, 1, 4, 16, 32, 64 perc) 100 ml térfogatú alikvotok 20 ml 5 M-os ecetsavoldatba történő injektálásával állítottuk le. Peptidkeverék komponens szarvasmarha egér patkány rák tripszin kimotripszin plazmin trombin endoproteináz Arg-C Tyrpszin c [mM] 40 0,0012 0,0075 0,0150 0,1500

15 Patkány kimotripszin kromatogramserege
Mikronalalitikai kurzus szubsztrátkönyvtár Patkány kimotripszin kromatogramserege reakcióidő 64 perc 32 perc 16 perc 4 perc 1 perc 0 perces állapot UV abszorbancia 220 nm-en Retenciós idő [perc]

16 A reproduktivitás ellenőrzése
Mikronalalitikai kurzus szubsztrátkönyvtár A reproduktivitás ellenőrzése szarvasmarha kimotripszin szarvasmarha tripszin Abszorbancia 220 nm-en Tartalmú peptid

17 A szelektivitás ellenőrzése I.
Mikronalalitikai kurzus szubsztrátkönyvtár A szelektivitás ellenőrzése I. 16 perces állapotok összehasonlítása

18 A szelektivitás ellenőrzése II.
Mikronalalitikai kurzus szubsztrátkönyvtár A szelektivitás ellenőrzése II. 16 perces állapotok összehasonlítása Phe tartalmú peptid fogyására normalizált diagram

19 Szerin proteinázok tesztelése
Csúcsterület csökkenés [%] 16 perces állapotok összehasonlítása