Plazmidok Készítette: Vásárhelyi Miklós. : E. Coli jól használható genetikai kísérletekben: Genomja kicsi(4,2*10 6 bázispár, kb. ezrede az emberének)

Az előadások a következő témára: "Plazmidok Készítette: Vásárhelyi Miklós. : E. Coli jól használható genetikai kísérletekben: Genomja kicsi(4,2*10 6 bázispár, kb. ezrede az emberének)"— Előadás másolata:

1 Plazmidok Készítette: Vásárhelyi Miklós

2 : E. Coli jól használható genetikai kísérletekben: Genomja kicsi(4,2*10 6 bázispár, kb. ezrede az emberének) Haploid: mutációkat nem tudja elnyomni egy másik allél Rövid osztódási idő(20 perc) A genetikai kísérletekhez szükség van a DNS átvitelére a baktériumok között! Bizonyítás: Lederberg és Tatum E.Coli K12 törzs Kétszeres mutánsokat alkalmaztak, hogy a revertánsok ne tegyék értékelhetetlenné a kísérletet A törzs met- bio- thr+ leu+ B törzs met+ bio+ thr- leu- Minimál táptalaj: Nincs növekedés met+ bio+ thr+ leu+ Rekombinánsok kinőnek

3 DNS közvetlenül vagy egyik auxotróf sejt felhasadása után jut-e át a másikba? Egyik törzs sejtjeit lizálták majd szűrték az így kapott sejtmentes DNS tartalmú szűrletet, hozzáadták a másik törzs ép sejtjeihez d enem tapasztaltak rekombinációt. A baktériumok közvetlen érintkezéssel cseréltek DNS-t: konjugáció A konjugációt az egyik baktérium felszínén kialakuló csöves szerkezet(F pilus) teszi lehetővé. Pilus üreges a konjugáció során megrövidül, valószínűleg nem a DNS átvezetésére szolgál csak közelíti egymáshoz a két sejtet.

4 DNS átadása egyirányú: Az F+törzset kezelték antibiotikummal a konjugáció továbbra is lejátszódott ha az F- törzset akkor nem kaptak rekombináns egyedeket. A rekombinánsokban a recipiens alléljai voltak többségben F+ a donor F- recipiens. A donor DNSének csak kis részéletét adja át nagy gyakorisággal.

5 F+ sejt nagy gyakorisággal képes F- sejtet F+-á alakítani. 10-ből 1-t. Más gének átvitelének gyakorisága 1:10 000 000-hoz F faktor nagyon könnyen kerül át egyik sejtből a másikba valószínűleg más mechanizmussal mint a többi gén F+ E.Coli és másik baktériumfaj(Serretia marcescens) sejtjeit keverték. A recipiensben az eddigiektől eltérő sűrűségű DNS jelent meg aminek sűrűsége az E.Coli DNSével volt azonos sűrűségű. Ez az új DNS mennyiség az F faktor, mert az adódik át nagy gyakorisággal. F faktor egy plazmid: gazdasejt kromoszómájától replikálódik, gyűrű alakú, extrakromoszomális DNS

6 Hfr törzsek Az F plazmid néha rekombinálódik Hfr-ré alakítja a sejtet és mobilizálja. F faktor önmaga átadásának képességét elveszíti és átadja azt a gazdakromoszómának.

7 F’ plazmidok Mindig ugyanoda épül be a a kromoszómába ahol az eredeti Hfr-ben volt. A normál plazmidnál nagyobb gyakorisággal képez Hfr sejtet Magával vitt egy darabot a gazdakromoszómából, amikor Hfr sejtben tartózkodott. Ennek köszönhetően képes mindig ugyanoda beépülni.

8 Plazmid: egyirányú replikáció EcoRI restrikciós endonukleáz elhasítja a plazmidot Replikációs buborék csak egyik irányba nő

9 pBR322

10

11 pUC vektorok pBR322-ből származik DNS 40%át eltávolították köztük a tetraciklin rezisztencia gént. Sokszoros klónozóhely Részleges béta-galaktozidáz gén, ha bekerül olyan sejtbe ami szintén tartalmaz részleges β-gal gént akkor intracisztronos komplementációval működő enzim keletkezik X-gal indikátor a táptalajba a β-galaktozidáz galaktózra és kék festékre bontja: telepek kékülnek Irányított klónozás: a sokszoros klónozóhely biztosítja. Olyan DNS darab beépítése melynek végeit különböző restrikció endonukleázokkal hasítják.

12 pUC18