Heterológ fehérje-termelés prokarióta expressziós rendszerekben

Az előadások a következő témára: "Heterológ fehérje-termelés prokarióta expressziós rendszerekben"— Előadás másolata:

1 Heterológ fehérje-termelés prokarióta expressziós rendszerekben

2 www.wzw.tum.de/gene-quantification/ mrna.html

3 Indukálható promóter rendszer;
Újra a vektorokról A baktérium expressziós vektorok néhány tulajdonsága: Indukálható promóter rendszer; Ki-be kapcsolás Fehérje fúziós tag; Tisztítás, oldhatóság

4 Általános tanácsok prikarióta génexpresszióhoz
Leggyakoribb hibák: 1. Intront ne felejtse el kivágni 2. Ellenőrizze az inzert orientációját 3. Fúzió frame-ben legyen 4. Nincs poszttranszlációs modifikáció = nem biztos, hogy aktív a termék

5 Intronok Nem probléma, ha cDNS-t klónozunk
mrna.html

6 Az inzert orientációja: alkalmazzon inkompatibilis ragadós végeket
pfdg/ teaching/genes.htm

7 Fúziós fehérjék. Ha fúziós fehérjét kíván expresszáltatni,
akkor győződjön meg arról, hogy mindkettő ugyanabban a leolvasási keretben van-e pfdg/ teaching/genes.htm

8 Poszttranszlációs modifikáció
Golgi van az eukarióta sejtekben, a prokariótákban nincs nucleus Golgi

9 Trans-Golgi Network RER = Rough endoplasmic reticulum P R O T E I N A
perth.uwlax.edu/faculty/howard/

10 E. coli-ban mindez nincs
glikozilezés – E. coli-ban mindez nincs Cis -Golgi Medial -Golgi Medial -Golgi Cis –Golgi Medial -Golgi

11 Az expresszió hatékonysága E. coli-ban
Függ a: 1. Promóter és terminátor típusa 2. mRNS affinitása a riboszómához 3. A transzgén kópiaszáma és helyzete (kromoszóma, vagy plazmid) 4. A fehérje végtermék lokalizációja a sejtben 5. A transzláció hatékonysága a gazdában 6. A fehérje termék stabilitása a gazdában Génről génre optimalizálni kell a rendszert Nincs egységes stratégia

12 A transzkripciót befolyásoló tényezők
Promóterek (szabályozhatók is) Prokarióta!! 2. Terminátorok Prokarióta!!

13 Baktérium promóter Pribnow box Promoter search Open promoter complex

14 A prokarióta promóterek közötti különbség kicsi, de fontos lehet
411

15 UP elem erősebbé teheti a promótert (RNS polimeráz kötődés)
Core promoter FIS sites UP element UP element

16 FIS protein = DNS kötődés és hajlítás (binding and bending)
FIS helyek a baktérium promótereknél növelik az expressziót

17 nem működnek E. coli-ban
Eukarióta promóterek csak első pillantásra hasonlítanak a prokarióta promóterekhez Minden szekvencia más, euk. promóterek nem működnek E. coli-ban

18 Prokarióta terminátorok
hasznosak

19 Egy jó transzkripciós terminátor erősen javítja a transzláció hatékonyságát
Korlátozza az átírást, plazmid replikáció, stabilitás!

20 A transzlációt befolyásoló tényezők
1. Riboszóma kötő hely (RBS) 2. Kodon használat 3. mRNS stabilitás

21 Riboszóma-kötőhely (Ribosome binding site (RBS)) =
<10 nt A gén 5’ végén a hajtű kerülendő (GC tartalom minimális legyen) A második kodon vizsgálata; Jó ha AAA – lizin (13.9% az E.coli géneknek). 15x-ös növekedés.

22 Néhány gént teljesen újra kell szintetizálni.
kodon preferencia tRNS ellátottság a gazdában. Néhány gént teljesen újra kell szintetizálni. Gln (Q) CAA 97.0 CAG 3.0 Leu (L) TTA 55.5 CTC 9.7 CTA 4.7 CTG 0.7

23 Kodon használat: E. coli ↔ ember

24 Kodon optimalizálás Új gén kémiai szintézis Másik gazda
Módosított gazda tRNS-ek termeltetése

25 További optimalizálásnak gyakorlati jelentősége nem volt.
human HG expressziója Dictyostelium-ban (eukarióta példa, de E. coli-ban is hasonló problémák) human chorionic gonadotropin Dictyostelium –ban (AT >75%) Kodon használat %. 4-5x-ös növekedés. Érdekesség: csak az első as volt fontos (5’-specifikus hatás, riboszóma megáll és leesik). További optimalizálásnak gyakorlati jelentősége nem volt.

26 Kereskedelmi E. coli törzsek ritka kodon génekkel
BL21 (DE3) CodonPlus-RIL (AT-rich compatible) arginine (AGG, AGA), isoleucine (AUA) and leucine (CUA) BL21 (DE3) CodonPlus-RP (GC-rich compatible) arginine (AGG, AGA) and proline (CCC) Rosetta or Rosetta (DE3) AGG/AGA (arginine), CGG (arginine), AUA (isoleucine) CUA (leucine)CCC (proline), and GGA (glycine)

27 RNS transzkriptum stabilitás
Prokariótákban a legtöbb mRNS kis félélet-idejű Növelni, több idő a transzlációhoz Az 5’ és a 3’ szekvenciák befolyásolják az RNáz érzékenységet Kevés az információ

28 Fehérje stabilitás Proteáz aktivitás a sejtben
2. N-terminális aminosav szekvencia 3. Belső szekvencia motívumok növelik a proteolízis lehetőségét P prolin E glutaminsav S szerin T treonin …. PEST aminosavak mutációja….

29 Proteáz hiányos gazda BL21, E. coli expresszió, lon (citoplazma)
ompT (periplazma). Nem lehet mindet, mert proteázok kellenek a metabolizmushoz.

30 N-terminális aminosavak hatása béta-galaktozidáz fehérje stabilitására
+ az N-terminálishoz ½ élet-idő Met, Ser, Ala > 20 óra Thr, Val, Gly Ily, Glu > 30 perc Tyr, Gln ~10 perc Pro 7 perc Phe, Leu, Asp, Lys 3 perc Arg 2 perc (gyilkos)

31 PEST szekvencia a humán CFTR fehérjében (cystic fibrosis)
P prolin E glutaminsav S szerin T treonin

32 Idukálható baktérium promóterek
Miért nem konstitutív, nagyon erős promóter? A szaporodáshoz idő kell A rekombináns (idegen) fehérje gyakran toxikus. A baktériumok a káros plazmidokat igyekeznek elveszíteni. indukció

33 BL(DE3) indukálható rendszer és a pET vektorok (Novagen)
yfg expressziója az erős promoterről pET23 T7 RNS polimeráz gén kromoszómába integráltatva a lac promóter és operátor szabályozása alatt 2) Laktóz analóg, IPTG, gazda termeli a T7 RNS polimerázt 3) Az E. coli gazda genomban ott a lacI (represszor) gén 4) Megbízható, pontos szabályozás, stabil gazda, szaporítás és termelés külön fázis

34 CRP CRP CAP = catabolite gene activator protein = CRP T7 polimeráz
cAMP T7 polimeráz

35 pETBlue: a lacZ gén a másik szálon
Kék-fehér screening

36 A legtöbb transzmembrán fehérje toxikus az E. coli-ra
A lac rendszer alap expressziója már elég (leaky promóter, szivárog), hogy a gazda ne, vagy csak nagyon rosszul növekedjen inducer nélkül is

37 Hogyan előzhető meg a szivárgás?
lacIq és lacIsq – mutáns E.coli törzsek “quantity” és “superquantity” represszor; Rengeteg represszor, de indukálható A célfehérje mennyisége a sejtekben IPTG

38 ARABINÓZ OPERON szigorúbb szabályozás…
ara operon Arabinóz izomeráz - araA - arabinóz → ribulóz Ribulokináz- araB – ribulózt foszforilezi Ribulóz-5-foszfát epimeráz - araD – ribulóz-5-foszfát→xilulóz-5-foszfát, tovább a pentóz foszfát útvonalba.

39 L(+)Arabinóz szükséges az expresszióhoz
Glükóz van (nincs cAMP) arabinóz van → expresszió nincs Ara represszor CAP cAMP Ara represszor Az AraC (Ara represszor) represszálja a cAMP kis koncentrációjánál a saját szintézisét és represszálja az AraBAD szintézist, amíg nincs arabinóz. Ara

40

41 Az arbinóz koncentrációjától függ az expresszió mértéke.

42 Indukció drága vegyület nélkül
Hőmérséklet növeléssel (ts fehérjék)

43 Pl promótert a cI represszor szabályozza (λ fág)

44 Hömérséklet szabályozás
28-32 ºC permisszív hőm.; Represszor stabil A célgénről nincs expresszió hőérzékeny cI 857 mutáns P 42 ºC nem-permissziv hőm.; Represszor inaktív Célgén erős expressziója Represszor szintézis TARGET GÉN

45 Triptofán operon – jól ismert

46 TRP operon alapú két-plazmid rendszer
Nincs triptofán gén !

47

48 Hova menjen megtermelt fehérje?
kiválasztás (!!) E. coli nem tudja Inclusion bodies (oldhatatlan) Citoplzma (oldható) Periplazmatikus tér (oldható/oldhatatlan)

49 Szignál szekvencia Gene III, fd fág periplazmatikus térbe

50 Hogyan tisztítsuk ki a fehérjénket?

51 Fúziós tag segítségével
6xHIS Tag (Invitrogen, Life Technologies, Novagen, QIAGEN):

52 GST – fúzió. Glutationhoz kötődik

53 Új generáció : önmagát levágó fúzió
Intein

54 centrális Homing Endonuclease Region az inteinekben, bifunkciós (DNS-t is vág)

55 New England BioLabs, pCYB Vectors/IMPACT System
CBD 5kDa chitin-binding domain Bacillus circulans

56 Specifikus proteáz hasító hely
Factor Xa Proteáz (Ile-Glu-Gly-Arg)