KROMOSZÓMA SZINTŰ HIBÁK KIMUTATÁSA, MÓDSZEREK Előadó: Dr. Kocsis Zsuzsanna Országos Kémiai Biztonsági Intézet Budapest, Nagyvárad tér 2. Helyszín: ELTE,

Az előadások a következő témára: "KROMOSZÓMA SZINTŰ HIBÁK KIMUTATÁSA, MÓDSZEREK Előadó: Dr. Kocsis Zsuzsanna Országos Kémiai Biztonsági Intézet Budapest, Nagyvárad tér 2. Helyszín: ELTE,"— Előadás másolata:

1 KROMOSZÓMA SZINTŰ HIBÁK KIMUTATÁSA, MÓDSZEREK Előadó: Dr. Kocsis Zsuzsanna Országos Kémiai Biztonsági Intézet Budapest, Nagyvárad tér 2. Helyszín: ELTE, 2010. 10. 20.

2 Kompartmentalizáció Prokarióta sejtek Eukarióta sejtek Kromatinalapszerkezet: nukleoszóma * DNS kettős spirál és a hisztonok alkotják * Hisztonok: bázikus fehérjék (argininben és lizinben gazdag) * 5 osztályuk van: H1H1, H2A, H2B, H3 és H4 nukleoszomális hisztonok Hisztonkorong (oktamer): 8 hisztonmolekulából álló (2*4) 2 csavarulatban 146 bázispárnyi DNS tekeredik rá 2 korong között kb. 60 bp linkerrégió + H1 molekula

3 Kromoszóma morfológia testvérkromatidák centroméra hosszú kar rövid kar Eukromatikus régió: aktív géneket tartalmaz (génexpresszió, RNS szintézis) Heterokromatikus régió: inaktív DNS szakaszok konstitutív heterokromatin (pl. centromer) fakultatív heteroktromatikus régió

4 Kromoszóma territórium Egy adott kromoszóma a sejtmag egy adott régiójában található. Szigorú sejtmagi rend.

5 Genom: a sejtmagban található összes genetikai információ. Kromoszóma: A genetikai információt tároló strukturális egység. Kromoszóma száma, morfológiája szervezettsége fajra jellemző és állandó. Fajok ecetmuslica rozs galamb egér patkány ember mezei nyúl kutya ponty páfrány Kromoszómaszám 8 14 16 40 42 46 48 78 104 1200 Humán kromoszómaGének 12 968 13748 18766 21303 X1184 (Barr test) Y231 (mikrodeléció meddőség) Nemhez kötött öröklődés G-sávos normál női karyotípus Humán lymphocyta kromoszóma preparátum

6 A sejtek kromoszómaszáma fajra jellemző, állandó érték. A testi sejtekben a homológ kromoszómák nagyságuk szerint párokba rendezhetők.homológ kromoszómák A testi sejtekben a kromoszómakészlet kétszeres, azaz diploid.diploid Az ember testi sejtjei 46 kromoszómát tartalmaznak. Az ivarsejtek kromoszómaszáma a testi sejtekének a fele, a petesejt és a hím ivarsejt haploid.haploid Az emberek ivarsejtjeiben 23 kromoszóma található. A nők sejtjeiben két homológ X kromoszóma található, a korai embrionális fejlődés elején a sejtek egyik X kromoszómája inaktiválódik (Barr-test).

7 Telomer: - kromoszóma vége - rövid TTAGGG szakasz több ezerszeres mennyiségben (20-25 ezer bázispár) genetikai óra, telomer rövidülés öregedés 2009 orvosi Nobel Díj - minden osztódáskor 100 bp rövidülés a DNS polimeráz enzim működéséből adódóan - egészséges sejtekben a telomeraz inaktív és - Az emberi sejt 50 osztódásra képes. - 50 osztódás után a sejt apoptózissal meghal. Tumoros sejtekben a telomer szerepe: -a telomeráz enzim aktivitása magasabb -Azt gondolják, hogy a telomeráz enzim retrovírus eredetű. -Ivarsejtekben is! Öregedés, rák, stabil kromoszóma

8 MITOZIS A mitózis gondoskodik a szülői és az utódsejt azonos kromoszómakészletéről. A sejtosztódás S fázisában a kromoszómák anyaga megkettőződik. A mitózis kromoszóma számtartó osztódás. * * *

9 MEIOZIS A meiozis a kromoszóma-számfelező redukciós osztódása, ivarsejt képződésének módja. Az S fázisban 4C-re duplázódó DNS tartalom két egymást követő osztódás során a DNS tartalom C-re redukálódik. A petesejt és a hím ivarsejt haploid. Az emberek ivarsejtjeiben 23 kromoszóma található, tehát fele a testi sejtekénél.haploid

10 A mitózis és meiózis összehasonlító elemzése

11 X-kromoszóma inaktiváció A nőstény emlősök sejtjeiben Az egyik X-kromoszóma inaktiválódik (random módon), X f X v. Az inaktivált X kondenzálódik - Barr-testecske. Bizonyos sejtek utódai együtt maradnak (sejtklónok). A nőstény emlősök teste mozaikos, vagyis olyan sejtek klónjainak a keveréke, amelyekben hol egyik, hol a másik X aktív. Heterozigótákon detektálhatók lehetnek a foltok. Vörös/fekete tarka macskák esete

12 Hemofilia B IX. faktor A VIII. faktor Nemhez kötött recesszív megbetegedés

13 Vörös-zöld színtévesztés Férfiak Nők Vörös-zöld színtévesztés Nemhez kötött recesszív megbetegedés Fényérzékelő idegsejtek csapok (3 féle)

14 KROMOSZÓMA ABERRÁCIÓ TÍPUSAI: Strukturális kromoszóma aberráció: deléció inszerció transzlokáció Numerikus kromoszóma aberráció: poliploidia aneuploidia Genotoxikus anyagok a DNS-ben tárolt genetikai információt örökletes módon megváltoztatják.

15 Deléció kromoszóma szegmentek elvesztése Különböző humán betegségek delécióra vezethetőek vissza. A kis deléciók tolerálhatóak. A nagy deléciók nem tolerálhatóak, letalitáshoz vezetnek.

16 Cri du chat – macskasírás szindróma Az ember esetében a genom kiegyensúlyozatlanság miatt a legkisebb deléciók is komoly abnormalitást okoznak. A macskasírás szindróma estében az 5. kromoszóma rövid (p) karjának vége hiányzik. Mikroencefáliával, holdszerű arccal és szellemi elmaradottsággal jár. 4 év alatti halál. születéskori gyakoriság: 1/50,000

17 Rákos sejtek gyakran mutatnak deléciókat

18 DUPLIKÁCIÓ DUPLIKÁCIÓ: Kromoszóma szegmensek megkettőződése. Jó példa a duplikációra a Drosophila Bar mutációja.

19 Az X kromoszóma 16A régiójának kópia száma különböző

20 A gén duplikáció evolúciós szerepe Ha a gén fontos a szervezet számára nem változhat. De ha a génből több kópia van a képződő proteinek módosulhatnak és új funkciókat láthatnak el. Duplikációval keletkezett gén családok hasonló proteineket készítenek. Jó példa erre a globin gének, amelyekről α és β globin láncok szintetizálódnak, a hemoglobin szerkezeti alegységei.

21 A gén duplikáció lehetőséget ad, a mutációs változásoknak, a funkciók divergálásának Az emberi hemoglobin gén duplikációs változások eredménye. Különböző életkorokban különböző alegységek alakítják ki a működő hemoglobin molekulát. 3 h. korig az embrionális Hemg. Szülésig a magzati Hemg. 20-30% Szülés után 2α 2ß.

22 Inverzió: Egy kromoszóma szakasz 180 fokos megfordulásának az eredménye. pericentrikus inverzió magába foglalja centromert paracentrikus inverzió a centromert nem érinti, csak a kromoszóma egyik v. másik karját Gén környezet, gén kapcsoltság, génátírás módosul.

23 TRANSZLOKÁCIÓ: intrakromoszómális transzlokáció: Egy kromoszóma szakasz áthelyeződése ugyanabba a kromoszómába. interkromoszómális transzlokáció: Nem homológ kromoszómák közötti transzlokáció. Transzlokáció során nincs genetikai anyag vesztés. A gének pozíciója azonban megváltozik.

24 Down szindróma: 14 és 21-es kromoszóma közötti Robertson transzlokáció. A 21-es krom. transzlokációja a 14-es krom.-ra eredményezi a familiáris Down syndromát.Örökölhető. 21-es kromoszóma triszómia (Osztódási hiba) Az anya életkorának előrehaladtával (40-45 év felett) az előfordulási gyakoriság exp. növekszik. Prenatális szűrés. Születéskori gyakorisága nagy: 1/500-1/700

25 Myeloid leukémia A 9-es és a 22-es kromoszómák közötti transzlokáció eredménye a “Philadelphia kromoszóma” Az esetek 90%-ban krónikus myeloid leukemiát okoz.

26 Burkitt’s lymphoma Az esetek 90% esetén a 8-as és 14-es kromoszómák közötti transzlokáció következménye. Transzlokáció következtében kialakuló pozíció effektus hatására kialakuló onkogének, sejtosztódást, rák keletkezését okozhatják.

27 Alternatív toxikológiai in vitro vizsgálatok előnyei: 1.in vitro körülmények között sejteken (élő állat alkalmazása nélkül ) 2.rövid idejű 3.olcsóbb 4.reprodukálható 5.nem használ élő állatot Az esetleges hatás megállapításához több, különböző módszerrel végzett vizsgálat egybehangzó eredményére van szükség. Ajánlott teszt rendszerek: 1. Egysejtűeken végzett tesztek 2. Rovartesztek 3. in vitro sejtkultúrákon végzett tesztek 4. in vivo mutagenitási tesztek 5. long term karcinogenitási állatkísérletek 6. humán epidemiológiai vizsgálatok Genotoxikus és daganatkeltő hatások vizsgálata

28 Azonos szakmai szabályok GLP= Good Laboratory Practice (Helyes Laboratóriumi Gyakorlat) ISO= International Organization for Standardization (Nemzetközi Szabványügyi Szervezet) Vizsgálati irányelvek OECD= Organisation for Economical Cooperation and Development (Gazdasági es Fejlesztési Együttműködési Szervezet) Kromoszóma aberráció in vitro vizsgálata emlős sejteken OECD TG 473 vizsgálati irányelv szerint Célja: azon kémiai anyagok meghatározása, amelyek kromoszóma aberrációt okoznak emlős sejtekben.

29 A kromoszóma aberráció vizsgálat  Sejtek Alkalmazható sejtvonalak jellemzői: stabil permanens v. primer sejtkultúrák (pl. CHO, humán lymfocita) jó növekedési képesség, rövid generációs idő, kariotípus stabilitás, állandó krom. szám. Kromoszómák alaki változatossága és stabilitása. kínai hörcsög ovárium fibroblaszt sejt (CHO, Puck1957)  Tápfolyadékok, tenyésztési körülmények Mesterséges tápfolyadékok elterjedése (Ham’s F12).  Sejtvonalak ellenőrzése: Kariogram Kromoszóma szám Mycoplazma Spontán kromoszóma aberráció gyakoriság Történeti kontroll

30  Vizsgálati anyag előkészítése: kémiai összetétel, szennyeződés, stabilitás oldószer kiválasztása hígítási sor készítése stabilitás vizsgálat archiválás  Elő-kísérlet:  citotoxicitási vizsgálat MTT-assay (mitokondriális szukcinát-dehidrogenáz enzim)  mitotikus index meghatározása MI: A metafázisban lévő sejtek és a sejtpopuláció összes sejtjének aránya. A sejtpopuláció proliferációjának a mértékét jellemzi.  Koncentráció Legkevesebb három elemezhető koncentráció. Citotoxikus anyag esetén: va. a festék-redukciót 50%-kal csökkenti. Nem citotoxikus anyag esetén: va. 5 mg/ml v. 0,01M

31  Metabolikus aktiválás: S9 alkalmazása rágcsálók enziminducerrel (Aroclor 1254, v. fenobarbiturát és β- naftoflavon) kezelt májából előállított poszmitokondriális frakció (S9) kofaktorokkal kiegészítve (ADPH, glukóz-6-foszfát). S9 végkoncentráció 1-10% közötti. citokróm P450 enzim aktiválása. Indirekt mutagének kimutatására alkalmas Direkt-és indirekt-mutagén anyagok

32  Kontrollok: Metabolikus aktiválás nélkül: MMS, EMS, Mitomycin-C Metabolikus aktiválással: CP, Benz(a)pirén Oldószer. tápfolyadék Archiválás  Kezelési idők : 4 óra +S9 4 óra -S9KIÉRTÉKELÉSNegatív pozitív24 óra -S9 ismétlés48 óra -S9

33  Kolhicinezés: Célja a metafázisos kromoszómák összegyűjtése Őszi kikerics (Colchicum autumnale) hagymájából készült kivonat. Köszvény gyógyítására alkalmazták. A kolhicin sejtosztódás gátló, a mitózis metafázisában. Normál esetben a sejtek 2-5%-a osztódik, néhány órás kolhicinezés összegyűjti a sejteket a metafázisban, akár 40-50 %-uk is blokkolt metafázisban található. A kolhicin a magorsó mikrotubulusaihoz kötődik.

34 Kromoszóma preparátum  Fénymikroszkópos értékelés kromatid típusú aberrációk:kromoszóma típusú aberrációk:delécióexchange

35 CHO sejt, kezeletlen kontroll. Felvétel: OKBI. MSBO. 2010.

36 CHO sejt, Deléció. Felvétel OKBI. MSBO. 2000.

37 CHO sejt. Deléció. Felvétel: OKBI. MSBO 2000.

38 Humán limfocita. Kezeletlen kontroll. Felvétel: OKBI. MSBO. 2000.

39 A testi sejtek kromoszómáiban a testvér-kromatidák közötti kicserélődés. reciprok DNS csere. Láthatóvá tehető, ha két sejtcikluson át bróm-dezoxi-uridinnel (timidin-analóg) jelöljük. Hoechst festés, majd UV kezelés, klasszikus Giemsa festés. Az SCE nem kromoszómaaberráció (Ctr. SCE 5). Az SCE már olyan kis vegyi mutagén-karcinogén expozíció kiváltja, amelyik még nem okoz krom. aberrációt. Alkalmazása primer prevencióban. B.19. IN VITRO EMLŐSSEJT TESTVÉR – KROMATID KICSERÉLŐDÉS (SISTER CHROMATID EXCHANGE, SCE) VIZSGÁLAT OECD TG 479

40 Bloom syndroma Örökletes betegség, családi halmozódás 15q26.1, a BLM gén mutációja. Fokozott sister chromatid exchange (SCE) és spontán kromoszóma törékenység. DNS repair enzimek károsodása Jelentős mutagén túlérzékenység. normál sejtBloom syndromás beteg sejt

41 A KROMOSZÓMA INSTABILITÁST JELLEMZI a/ a kromoszóma törések nagy száma b/ a testvér kromatida kicserélődések nagy gyakorisága c/ a magasabb daganatképződési kockázat d/ DNS reparációs hibák Bloom szindróma

42 B. 18. Nem-tervezett DNS-szintézis (UDS) in vitro vizsgálata emlős májsejteken OECD TG 482 Primer hepatocita sejtkultúra. Felvétel: OKBI. MSBO. 2000.

43 In vitro mikronukleusz teszt Validált (OECD Guideline 487) Kromoszóma mutációk kimutatására alkalmas Kb 80% egyezés a kromoszóma aberráció teszttel, érzékenyebb, olcsóbb, gyorsabb Mikronukleusz: a sejtmagnál kisebb méretű, membránhatárolt DNS darabok, amelyek a citoplazmában jelennek meg a sejtosztódás zavara esetén

44 A mikronukleusz képződés módjai

45 Köszönöm Figyelmeteket!