Laboratóriumi diagnosztikai módszerek

Az előadások a következő témára: "Laboratóriumi diagnosztikai módszerek"— Előadás másolata:

1 Laboratóriumi diagnosztikai módszerek

2 A nagyüzemi szarvasmarha állományok anyagforgalmi ellenőrzése
anyagcsere-profilvizsgálatok, nutritív-profil vizsgálatok, szűrővizsgálatok.

3 Anyagcsere profilvizsgálatok
Anyagforgalmi zavarok felderítése, rendellenességek korai felismerése. Csoportosan tartott, hasonlóan takarmányozott és hasonló teljesítményű állatokban alkalmazható. Eredmények  állományszintű következtetések (állatcsoporton belüli kiegyenlítettség értékelése). Compton Metabolic Profile Test (Payne, 1970) 13 vérparaméter 7 nagy tejhozamú (csúcstermelésű), 7 közepesen termelő (frissen ellett), 7 szárazonálló tehén.

4 Nutritív profilvizsgálatok
Táplálóanyagokkal (energia és fehérje) való ellátottság megítélése a takarmányok tápanyagtartalma és vérparaméterek alapján. Blowley: 4 hetenként, 6 egyed, 3 vérparaméter (glükóz, karbamid, albumin).

5 A szarvasmarha-állományok komplex takarmányozási és anyagforgalmi értékelése
Anyagforgalmi zavarok korai felderítése (vér-, tej-, vizelet-, bendőtartalom, bélsár- és szőrvizsgálat), optimális takarmányozás megvalósítása (táplálóanyag-, makroelem-, mikroelem-ellátás).

6 Beviteli táplálóanyag-egyenleg
Eredmények értékelése Beviteli táplálóanyag-egyenleg vérben levő, vizelettel és bélsárral ürülő elemek aránya, fedőszőrök mikroelem tartalma.

7 Eredmények értékelése
energia- és fehérjeforgalom, szárazanyag- és nyersrost-ellátás, Ca- és P-egyensúly, Na- és K-, mikroelem-, vitamin ellátottság, jelentősebb anyagcsere betegségek vizsgálata (zsírmobilizációs betegség, ketózis, sav-bázis egyensúly állapota).

8 Az anyagforgalmi profilvizsgálatok leggyakrabban vizsgált vérparaméterei
A vizsgált mutató A változás iránya és oka Anorganikus foszfát  P-ellátási zavar AST  máj- és izomkárosodás Glutation-peroxidáz  Se-hiány, de nem nő fokozott Se ellátáskor Glükóz  energiahiány Hemoglobin  szubsztráthiány (Fe, folsav, AA) Kalcium  ellés után és a Ca-ellátás súlyos zavara Karbamid  fehérjetúletetés,  májkárosodás, fehérjehiány Ketonanyagok energiahiány Koleszterin  májkárosodás Magnézium  ellátási zavar, stressz Összfehérje  fehérjetúletetés, gyulladás,  fehérjehiány Szabad zsírsav  energiahiány

9 Szűrővizsgálatok Adott betegség felderítése,
védekezés eredményesebbé tétele, pl. tőgygyulladás felmérése.

10 Masztiteszt próba Tőgynegyedenként 2-3 ml tej + 2-3 ml reagens.
Elbírálás: az elegy konzisztenciájának és színének változása alapján. Magvas sejtek (hámsejtek, leukocyták) mennyisége  (DNS).

11 Masztiteszt próba - változatlan szín és állomány = egészséges tőgynegyed, + néhány pehely, változatlan szín = kétes tőgynegyed, szubklinikai tőgygyulladás valószínűsíthető, ++ nyálkás csomók, pelyhek, lila szín = szubklinikai tőgygyulladás, +++ gyors sűrűsödés, nyálkásodás, bíborlila szín = kezdődő klinikai tőgygyulladás, ++++ kocsonyás, összeálló elegy, bíborszín = klinikai tőgygyulladás. Kémhatás jelzése (<6,5-6,7<).

12 Immundiagnosztikai módszerek

13 Immunológiai alapok Immunológiai folyamatok tényezői
Antigén fogalma Ellenanyagok (immunglobulinok) jellemzői Humorális immunválasz Celluláris immunválasz Immunológiai vizsgálómódszerek

14 Elsődleges védelmi vonal
Külvilágból károsító hatások folyamatosan érik a köztakarót és a nyálkahártyákat. Ép bőrfelszín (+baktériumok) „só~, sav~, faggyúköpeny” Szekrétumok (lizozim) könny, orrnyálka, nyál Légúti nyálka, csillóshám Bélnyálka és a természetes baktériumflóra Gyomor savi pH

15 Immunológiai folyamatok tényezői
Antigének Ellenanyagok Az immunrendszer sejtjei Az immunrendszer szervei

16 Antigének immunválaszt kiváltó anyagok Jellemzői:
A szervezetet specifikus ellenanyagok képzésére késztetik. A képződött ellenanyagokkal in vivo és in vitro reagálnak.

17 Antigének Fajtái: komplett antigének (Mr >4-5 kD) egyszerű, vagy összetett fehérjék, poliszacharidok, haptének = reaktív, de nem immunogén anyagok, heterológ antigének = a gazdaszervezettel nem azonos fajból származnak (vírusok, baktériumok, paraziták vagy más állatok szervei, sejtjei, illetve makromolekulái), izoantigének = azonos fajból származnak (szerkezetük az egyedre, csoportra jellemző, pl.: ún. vércsoport-, ill. lymphocyta-(MHC) antigének), autoantigének = szervezet saját anyagai (makromolekulái), keringéstől (immunrendszertől) elzártan, pl. szemlencse fehérjéje, agyszövet, ondósejtek. Immunkompetens sejtekkel találkozás  autoimmunbetegség.

18 Ellenanyagok (antitest / antibody)
Az immunkompetens sejtek által termelt ellenanyagok a szérum gammaglobulin frakciójába sorolható fehérjék (immunglobulinok).

19 Ellenanyagok (antitest / antibody)
Az immunkompetens sejtek által termelt ellenanyagok a szérum gammaglobulin frakciójába sorolható fehérjék (immunglobulinok). Molekulaszerkezetükre jellemző egy Y alakú, két nehéz és két könnyű fehérjeláncból álló alegység.

20 Ellenanyagok (antitest / antibody)
Az immunkompetens sejtek által termelt ellenanyagok a szérum gammaglobulin frakciójába sorolható fehérjék (immunglobulinok). Molekulaszerkezetükre jellemző egy Y alakú, két nehéz és két könnyű fehérjeláncból álló alegység. A nehézláncok öt típusa (, , , , µ) alapján emlősökben öt immunglobulin (Ig) osztályt különböztetünk meg (IgA, IgD, IgE, IgG, és IgM).

21 Ellenanyagok (antitest / antibody)
Az immunkompetens sejtek által termelt ellenanyagok a szérum gammaglobulin frakciójába sorolható fehérjék (immunglobulinok). Molekulaszerkezetükre jellemző egy Y alakú, két nehéz és két könnyű fehérjeláncból álló alegység. A nehézláncok öt típusa (, , , , µ) alapján emlősökben öt immunglobulin (Ig) osztályt különböztetünk meg (IgA, IgD, IgE, IgG, és IgM). A madarakban az IgG analóg neve IgY.

22 Az immunrendszer sejtjei
Limfocita (T-, B-sejt) Monocita (makrofág) antigén prezentáló sejt APC Granulocita (mikrofág) Neutrofil (bekebelezés, H2O2, proteolízis) Eozinofil (Ag-IgE –komplex, allergia) Bazofil (szöveti hízósejt, IgE-köt)

23 Az immunrendszer szervei Funkcionálisan
Elsődleges (központi) Thymus, Csontvelő, (bursa Fabricii). Másodlagos (perifériális) Lép, nyirokcsomók, Bél- (GALT), Egyéb- (MALT) nyálkahártya.

24 Immunrendszer Természetes, vagy veleszületett, de nem specifikus (filogenetikailag ősibb). Szerzett, vagy adaptív, specifikus (filogenetikailag fiatalabb).

25 Az immunrendszer működése
Celluláris (sejtek általi) reakciók, Humorális (sejtek jól jellemezhető fehérje típusú szekrétuma által végrehajtott) reakciók.

26 Immunitási formák Természetes Mesterséges Aktív (antigén) Passzív
Egyedi életben Ag (1), immunválasz. Ag (2) (TM+BM), hatékonyabb és gyorsabb válasz. Passzív (ellenanyag)

27 Immunitási formák Természetes Mesterséges Aktív (antigén) Passzív
Egyedi életben Ag (1), immunválasz. Ag (2) (TM+BM), hatékonyabb és gyorsabb válasz. Passzív (ellenanyag)

28 Immunitási formák Természetes Mesterséges Aktív (antigén) Passzív
Egyedi életben Ag (1), immunválasz. Ag (2) (TM+BM), hatékonyabb és gyorsabb válasz. Passzív (ellenanyag) Maternális Diaplacentáris Kolosztrális Szik (tojás) IgY

29 Immunitási formák Természetes Mesterséges Aktív (antigén) Passzív
Egyedi életben Ag (1), immunválasz. Ag (2) (TM+BM), hatékonyabb és gyorsabb válasz. Passzív (ellenanyag) Maternális Diaplacentáris Kolosztrális Szik (tojás) IgY Hiperimmun savóval oltás (adott antigénre specifikus ellenanyagot (IgG) tartalmazó fajazonos szérum): preventív céllal, terápiás céllal.

30 Immunológiai vizsgálómódszerek

31 Az immundiagnosztikai próbák csoportosítása
A vizsgálat célja szerint fertőző betegségek diagnosztikája, mikroorganizmusok, vagy azok antigénjeinek identifikálása, immunrendszer működése, vagy működési rendellenességeinek meghatározása, autoimmun kórképek diagnosztikája.

32 In vitro módszerek ún. klasszikus szerológiai próbák (vérsavóban lévő ellenanyag kimutatására), celluláris próbák (sejtes reakciók meghatározása), ún. jelzéses módszerek, immunhisztokémiai eljárások.

33 In vivo módszerek allergiás diagnosztikai próbák

34 Szerológiai próbák vérsavóból, tejből, folyadékokból (pl. liquor, hüvelynyálka, sperma)  ismert kórokozókkal, vagy azok antigénjeivel szembeni ellenanyagok kimutatása, szervezet fertőzöttségének megállapítása.

35 Szerológiai próbák antigén és ellenanyag kapcsolódása I. fázis
kémiai kötődés, néhány mp, nincs látható jele, II. fázis kolloidkémiai folyamatok, percek, vagy órák elteltével látható reakció.

36 Szerológiai próbák agglutinációs próbák (baktériumsejtek összecsapódása), precipitációs próbák (oldott antigének kicsapódása), komplementkötési próbák, vírusneutralizációs próba.

37 Szerológia próbák érzékenysége
Próba Kimutatható protein mennyisége (g/ml) Vírusneutralizáció 0,00005 ELISA 0,0005 Agglutináció 0,05 Hemagglutináció 0,01 Komplementkötés Precipitáció (folyadék) 18,00 Precipitáció (gél) 30,00

38 ún. titer-érték Adott vérsavó ellenanyag tartalmának kifejezése. A vérsavónak az a legmagasabb hígítási értéke, amelyben homológ antigénnel még látható szerológiai reakciót ad.

39 Agglutinációs próbák Baktériumok, sejtek (pl. vvs.), vagy antigénekkel kapcsolt korpuszkuláris anyagok (pl. latex) ellenanyagok hatására létrejövő összecsapódása. Brucellózis, malleus, baromfitífusz, paratífusz és leptospirózis diagnosztikája.

40 Agglutinációs próbák Tárgylemez-agglutinációs próbák,
Csőagglutinációs próbák, ABR (Abortus Bang Ring) próba, Coombs-próba, Hemagglutinációs próbák.

41 Tárgylemez-agglutinációs próbák
Vérsavó + antigén

42 Agglutinációs próbák Tárgylemez-agglutinációs próbák,
Csőagglutinációs próbák, ABR (Abortus Bang Ring) próba, Coombs-próba, Hemagglutinációs próbák.

43 Csőagglutinációs próbák
higított vérsavó + baktérium szuszpenzió

44 Agglutinációs próbák Tárgylemez-agglutinációs próbák,
Csőagglutinációs próbák, ABR (Abortus Bang Ring) próba, Coombs-próba, Hemagglutinációs próbák.

45 ABR (Abortus Bang Ring) próba
tejből brucellák ellen ható ellenanyagok kimutatása

46 Agglutinációs próbák Tárgylemez-agglutinációs próbák,
Csőagglutinációs próbák, ABR (Abortus Bang Ring) próba, Coombs- (antiglobulin-) próba, Hemagglutinációs próbák.

47 inkomplett (blokkoló) ellenanyagok kimutatására
Coombs-próba vvs ellen- anyag ellenanyag íantiglobulin) inkomplett (blokkoló) ellenanyagok kimutatására

48 Agglutinációs próbák Tárgylemez-agglutinációs próbák,
Csőagglutinációs próbák, ABR (Abortus Bang Ring) próba, Coombs-próba, Hemagglutinációs próbák (baromfipestis elleni antitestek kimutatása, vakcinázás hatékonyságának ellenőrzése).

49 Precipitációs próbák Az ellenanyag az oldatban lévő antigénnel reagál, és az ezt követő kolloidkémiai folyamatok hatására az antigén-ellenanyag komplex az oldatból csapadék alakjában válik ki.

50 Precipitációs próbák

51 Precipitációs próbák Csőprecipitációs próbák,
Agargél precipitációs próbák, Mancini próba (radiális immundiffúzió), Immundiffúziós próbák.

52 Csőprecipitációs próbák
precipitációs gyűrű vérsavó

53 Precipitációs próbák Csőprecipitációs próbák
ASCOLI-féle termoprecipitációs próba - lépfene fertőzöttség kimutatása, UHLENHUT-féle próba - különféle állatfajok fehérje antigénjeinek azonosítása, vagy a közöttük levő rokonság megállapítása (húsok faji származásának meghatározása).

54 Precipitációs próbák Csőprecipitációs próbák,
Agargél precipitációs próbák, Mancini próba (radiális immundiffúzió), Immundiffúziós próbák.

55 Precipitációs próbák Agargél precipitációs próba – Brucella ovis fertőzés, lovak fertőző kevésvérűsége, szarvasmarha leukózis, egyes vírus okozta baromfibetegségek kórjelzése, lineáris géldiffúzió (OUDIN-módszer), lineáris kettős géldiffúzió, kétdimenziós kettős géldiffúzió (OUCHTERLONY-módszer).

56 Agargél precipitációs próba

57 Precipitációs próbák Csőprecipitációs próbák,
Agargél precipitációs próbák, Mancini próba (radiális immundiffúzió), Immundiffúziós próbák.

58 Mancini próba ellenanyag antigén

59 Precipitációs próbák Csőprecipitációs próbák,
Agargél precipitációs próbák, Mancini próba (radiális immundiffúzió), Immundiffúziós próbák Immunelektroforézis (elektroforézis + immunprecipitáció).

60 Immunelektroforézis

61 Immunelektroforézis Rocket-elektroforézis

62 Komplementkötési próbák
Érzékeny szerológiai eljárás, amely az ellenanyagok, vagy antigének kis mennyiségének kimutatására is alkalmas. Brucellozis, malleus, tenyészbénaság, vírusos betegségek diagnosztikája.

63 Komplementkötési próbák
Antigén + ellenanyag (adszorbeáló felület) + komplement + ún. hemolitikus jelzőrendszer. komplement antigén + vérsavó juh vvs + hemolysin

64 Komplementkötési próbák

65 Vírusneutralizációs próba
Ismert vírusszuszpenziót az ellenanyag-tartalmú vérsavóval megfelelő arányban elegyítünk, majd a vérsavó vírus semlegesítő hatását szövet-tenyészetben, fiasított tyúktojásban, vagy kísérleti állatokban ellenőrizzük.

66 Szerológiai próbák értékelése
ellenanyagok kimutatása? korai - késői ellenanyagok (önmagukban, együttesen)  agglutináló, precipitáló, komplementkötő, vírusneutralizáló.  fertőzés lefolyása: precipitációs és agglutinációs próbák: friss fertőzések, komplementkötő próba: betegség előrehaladott szakasza, Coombs próba: akár betegség lefolyását követően.

67 Celluláris próbák Immunrendszer sejtjeinek válaszkészségét vizsgáljuk.
Élő lymphoid sejtekkel (perifériás fehérvérsejt) in vitro végzett vizsgáló eljárások, amelyek alkalmasak a szervezet immunstátusának meghatározására.

68 Celluláris próbák RCF Rosetta cell forming,
LST Lymphocyta stimulációs próba, Macrophagmigráció gátlás, Cytotoxikus reakció.

69 Immunrozetta-képzés fvs vvs

70 Celluláris próbák RCF Rosetta cell forming,
LST Lymphocyta stimulációs próba, Macrophagmigráció gátlás hosszú életű memóriasejtek (szekunder immunválasz) válaszképességét mérik. Cytotoxikus reakció effektor (killer) sejtek aktivitását méri.

71 Jelzéses módszerek Radioimmunológiai eljárások (izotóp):
RIA RadioImmune Assay (antigén), IRMA ImmunoRadioMetric Assay (ellenanyag), ELISA Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay, Immunfluoreszcencia, Avidin-biotin módszer, Immunoblot.

72 Jelzéses módszerek Radioimmunológiai eljárások
jelölt és jelöletlen reagensek versenyeznek a korlátozott számú fajlagos kötődési helyért, jelöletlen anyag koncentrációjának növelése  jelölt anyag kötődését gátolja, mintában, standardokban mért gátlások értékeinek összehasonlítása.

73 Jelzéses módszerek Radioimmunológiai eljárások (izotóp):
RIA RadioImmune Assay (antigén), IRMA ImmunoRadioMetric Assay (ellenanyag), ELISA Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay, Immunfluoreszcencia, Avidin-biotin módszer, Immunoblot.

74 ELISA antigén ellenanyag enzimmel konjugált antiglobulin
antigén-ellenanyag-antiglobulin +szubsztrát

75

76 Jelzéses módszerek Radioimmunológiai eljárások (izotóp):
RIA RadioImmune Assay (antigén), IRMA ImmunoRadioMetric Assay (ellenanyag), ELISA Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay, Immunfluoreszcencia, Avidin-biotin módszer, Immunoblot, Immunhisztokémiai eljárások.

77 In vivo módszerek Allergiás diagnosztikai próbák
meghatározott kórokozókkal való fertőzöttség, vannak-e a vizsgált szervezetben az alkalmazott allergénnel szemben áthangolódott sejtek.

78 In vivo módszerek Allergiás diagnosztikai próbák:
Általános, vagy termikus próba, Helyi, vagy lokális allergiás próbák: Szempróba, Bőrpróbák.

79 In vivo módszerek Általános, vagy termikus próba
Az allergént bőr alá, vagy a véráramba fecskendezzük. Az egész szervezetre kiterjedő általános reakciót vált ki (hőmérséklet emelkedése). + szervi, organikus reakció (izomremegés, szőrborzoltság, bágyadtság, étvágytalanság, az érverés és a légvételek számának emelkedése). + ún. gócreakció jelentkezése.

80 In vivo módszerek Helyi, vagy lokális allergiás próbák: Szempróba:
lovak malleolus fertőzöttségének kimutatása, kötőhártya: mallein cseppentése  savós-gennyes gyulladás, Bőrpróbák: intradermális próba (bőr irharétege), gümőkór, malleus, brucellózis kórjelzése, elbírálás: bőr megvastagodása, fájdalmassága + bőrduzzanat  3 mm, 2-3 mm és fájdalmas.

81 Tuberkulin (Mantoux) próba

82 Praeallergia: áthangolódási időszak (fertőzés  szenzibilis állapot; 14-21 nap).
Anergia: csökkent reaktivitású sejtek (szeptikémiás állapot, reakciókészség ). Parallergia: a szervezet tuberkulinnal szembeni érzékenysége más fajú Mycobacterium fertőződés következménye (közös antigén komponensek). Heteroallergia: egyes fertőző, vagy parazitás betegségek esetén: szövetkárosodás  atípusos mycobaktériumok hatolnak a szervezetbe.

83 Felhasznált irodalom Bárdos L., Husvéth F., Kovács M.: Gazdasági állatok anatómiájának és élettanának alapjai. Mezőgazda Kiadó, Budapest Brydl E. (szerk): A szarvasmarha anyagforgalmi betegségei és megelőzésük. Mezőgazdasági Kiadó, Budapest Gaál T. (szerk): Állatorvosi klinikai laboratóriumi diagnosztika. Sík Kiadó, Budapest, 1999. Tuboly Sándor: Állatorvosi járványtan. I. (állatorvosi mikrobiológia). Mezőgazda Kiadó, Budapest, 1998. Vrzgula L. et al.: A gazdasági állatok anyagforgalmi betegségei és megelőzésük. Mezőgazdasági Kiadó, Budapest