ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREK ELMÉLETE ÉS GYAKORLATA

Az előadások a következő témára: "ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREK ELMÉLETE ÉS GYAKORLATA"— Előadás másolata:

1 ELVÁLASZTÁSTECHNIKAI MÓDSZEREK ELMÉLETE ÉS GYAKORLATA
Dr. Kremmer Tibor VI. FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁS MÓDSZEREK GÉLKROMATOGRÁFIA EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM Budapest – 2013

2 GÉLKROMATOGRÁFIA SEC GPC GEL CHROMATOGRAPHY - GEL FILTRATION
MOLEKULA MÉRET SZERINTI ELVÁLASZTÁSÚ KROMATOGRÁFIA SIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPHY SEC GÉL PERMEÁCIÓS KROMATOGRÁFIA GEL PERMEATION CHROMATOGRAPHY GPC

3 Porath és Flodin (1954) Gel Filtration - GÉLSZŰRÉS
TÖRTÉNETI ÁTTEKINTÉS McBain (1929) Molecular Sieving - Molekula sziták, zeolitok – permutitok Deuel és Neukom (1954) Desalting - Poliszacharid gélek, sómentesítés Porath és Flodin (1954) Gel Filtration - GÉLSZŰRÉS Uppsala – Pharmacia Fine Chemicals, Sephadex – Sepharose gélek Gelotte (1960), Pedersen (1962), Flodin és Porath ( ) Size Exclusion Chromatography (SEC) Méret szerinti kizáródásos kromatográfia Szterikus-volumetrikus térfogati megoszlási modell Steere és Ackers (1962) Restricted Diffusion Chromatography Hjerten és Mosbach (1962) Molecular Sieve Chromatography A molekula „szitálás” matematikai modellje Moore (1964) Gel Permeatíon Chromatography (GPC) Casassa (1967), Ogston ( ) Termodinamikai értelmezés Ozmotikus nyomás – entrópia változás alapján Determann (1964) Gel Chromatography - GÉLKROMATOGRÁFIA

4 A GÉLKROMATOGRÁFIA ELVÁLASZTÁSI MECHANIZMUSÁNAK SZTERIKUS ELMÉLETI MODELLJE

5 Térhálós szerkezetű polidextrán alapú xerogél (Sephadex) pásztázó elektronmikroszkópos (SEM) képe.

6 PORÓZUS SZILIKA GÉL ELEKTRONMIKROSZKÓPOS KÉPE

7 GÉLKROMATOGRÁFIA AZ ELVÁLASZTANDÓ ANYAG(OK) Kémiai tulajdonságai:
Szerkezet – stabilitás Funkcionális csoportok Biológiai aktivitás Molekula méret-tömeg, eloszlás Kis molekulák – Makromolekulák, Biopolimerek Fizikai tulajdonságai: Oldékonyság (poláris-apoláris) Szolvatáció – hidratáció Alak (globuláris - fibrilláris), konformáció – aggregáció Hidrodinamikai jellemzők Stokes-f rádiusz, diffúziós állandó, belső viszkozitás, flexibilitás

8 GÉLKROMATOGRÁFIA AZ ÁRAMLÓ FÁZIS AZ ELUENS – OLDÓSZER POLARITÁSA
pH, IONERŐSSÉG, ION MINŐSÉG VISZKOZITÁS (KONCENTRÁCIÓ) ADALÉKOK detergensek, stabilizálók, antioxidánsok, antibakteriális vegyületek, stb,

9 GÉLKROMATOGRÁFIA AZ ÁLLÓ (GÉL) FÁZIS
A TÖLTET KÉMIAI ÖSSZETÉTELE - SZERKEZETE Xerogel - liogel, térhálós polimerek, Biokompatibilitás, SZERVETLEN OXIDOK SiO2, Al203, hidroxi apatit, TiO2, üvegszemcsék (CPG), SZERVES POLIMEREK Dextrán, agaróz, akrilamid, akril-metakrilát, poliéter- észter, polivinilalkohol, polisztirol-divinilbenzol, KEVERT TÍPUSOK Szervetlen-szerves - Si02- poliszacharid, Szerves-szerves – dextrán - agaróz, Egyéb polimerek - akrilamid - PS-DVB

10 AGARÓZ GÉL SZERKEZETE (Araki, 1956)

11 TÉRHÁLÓS DEXTRÁN GÉLEK (Sephadex) SZERKEZETE

12 N,N’-METILÉN BIS-AKRILAMIDDAL TÉRHÁLÓSÍTOTT POLIAKRILAMID GÉLEK

13 POLÁRIS – HIDROFIL GÉLKROMATOGRÁFIÁS TÖLTETEK
GFC - SEC POLÁRIS – HIDROFIL GÉLKROMATOGRÁFIÁS TÖLTETEK Elnevezés Összetétel Gyártó - Forgalmazó Sephacryl S Allil - dextrán akrilamid Pharmacia-LKB Superdex Dextrán-agaróz SynChrom GPC Polipropil-gliceril Waters- Millipore Sigmachrom GFC Dextrán - polietilénglikol Sigma-Aldrich Chitopearl Chitopack Kitin – kitosan poliszacharid Fuji Spinning Co. (Japán) Nucleosil Phenomenex GPC-P Daisogel 2205 SiO2 Macherey-Nagel Phenomenex Daiso (Japán) Unisphere Al2O3 Biotage HA Type 8 Hidroxiapatit Koken Science

14 APOLÁRIS – HIDROFÓB/ORGANOFIL GÉLKROMATOGRÁFIÁS TÖLTETEK
GPC – SEC APOLÁRIS – HIDROFÓB/ORGANOFIL GÉLKROMATOGRÁFIÁS TÖLTETEK Elnevezés Összetétel Gyártó-Forgalmazó Styragel HMW PS – DVB Waters Fractogel TSK Szilikagél, ill. Merck G 3000 SW-PW Polivinil - sztirol polimer Toyopearl HW 55F TosoHaas Metachem GPC PS - DVB Metachem Tecnol. Jordi Gel DVB 500 Polidivinil benzol Jordi Associates BioSep SEC Phenomenex Asahipak HO Polivinil alkohol Asahi Chem. Co. PL gel MIXED Polietilénnel kevert PS-DVB Polymer PL Aquagel OH Polihidroxid Polihidroxil Lab Ltd, Shodex UT 800 KF 80 M Poliszachariddal kevert PS – DVB kopolimer Showa Denko

15 Kereskedelmi HPLC-SEC oszloptöltetek
Nanorészecskék, makromolekulák, biopolimerek elválasztására Elnevezés Összetétel Gyártó-Forgalmazó Sepharose CL 2B, 4B, 6B Dextrán-agaróz Pharmacia LKB Sephacryl S 200, S 300 Dextrán-akrilát Styragel HMW PS – DVB Waters Fractogel TSK Szilikagél, ill. polimer Merck TSKgel G 3000 SW-PW Polivinil - sztirol polimer TosoHaas Toyopearl HW 55F, -75 Etilénglikol/metakrilát kopolimer Shodex HA 30 Hidrofil PS - DVB Shodex UT 800 KF 80 M Poliszachariddal kevert PS – DVB Showa Denko PL aquagel OH Polihidroxid- polimer gyanta Polymer Laboratories PL gel MIXED Polietilénnel kevert PS-DVB Phenogel OH Hidrofil polimer gyanta NUCLEOGEL GFC Macherey-Nagel BioSep SEC Phenomenex Asahipak HO Polivinil alkohol Asahi Chem. Co. Jordi Gel DVB 500 Polidivinil benzol Jordi Associates Metachem GPC PS - DVB Metachem Technology

16 Sephadex G gélek kromatográfiás tulajdonságai Géltípus
Gélágy térfogata cm3/g xerogél* Kizáródási moltömeg (kDa) Frakcionálási tartomány (kDa) G-10 2 – 3 ≈ 0,7 0,7 alatt G-15 2,5 – 3 – 5 ≈ 1,0 1,0 alatt G-25 4 – 6 5 1 –5 G-50 9 – 11 30 1,5 – 30 G-75 12 – 15 70 3 – 70 G-100 15 – 20 150 4 – 150 G-150 20 – 30 400 5 – 400 G-200 30 – 40 800 A száraz (xerogél) szemcsék mérete (μm) fajtától függően: durva (coarse) , közepes (medium) , finom (fine) 20-80, vagy szuperfinom (superfine) lehet.

17 HOMODISZPERZ SZTIROL-DIVINIL BENZOL KOPOLIMER SZEMCSÉK (BioBeads, 5 m) SEM KÉPE

18

19

20 HOMODISZPERZ SZFEROID SZEMCSÉK TÉRBELI ILLESZKEDÉSÉNEK HEURISZTIKUS MODELLEZÉSE

21 HOMODISZPERZ SZFEROID SZEMCSÉK 6 ÉS 8 KOORDINÁCIÓS SZÁMMAL ILLESZKEDŐ TÉRBELI MODELLJEI

22 A GÉLKROMATOGRÁFIA SZTERIKUS-VOLUMETRIKUS EGYENLETE

23 AZ ÁLLÓ (GÉL) FÁZIS SZERKEZETE
A GÉLEK SZÁRAZANYAG (TÉRHÁLÓ) TARTALMA (súly %) Agaróz – 1.5 Sephadex Poliakrilamid A gélszemcsék 70 – 95 %-a víz (oldószer) ! ERŐSEN HIDRATÁLT (SZOLVATÁLT) SZERKEZET A víz (oldószer) molekulák (dinamikus egyensúlyban) a térhálóhoz rögzített térszerkezetet képeznek. A rögzített folyadéktér hozzáférhetőségét a térhálós szerkezet sűrűsége (keresztkötések száma, orientációja, „pórusméret”) és az oldott (elválasztandó) molekula mérete (tömege) határozza meg.

24 Az elválasztás technika szemlélete szerint a
GÉLKROMATOGRÁFIA a FOLYADÉK-FOLYADÉK MEGOSZLÁSI KROMATOGRÁFIA SPECIÁLIS HATÁRESETE ahol az álló és az áramló fázis ugyanaz az oldószer, a szerkezetileg rögzített és a folyadék halmazállapotú vízmolekulák. Az ELVÁLASZTÁS MECHANIZMUSA a fázisok közötti térfogati megoszlás (fázisarány, megoszlási együttható) a molekula méretének (tömegének) függvénye. Kav ~ f(log M) (A molekula rendelkezésére álló tér(fogat), „oldékonysága” különböző a két fázisban)

25 (Vt – V0) állandó érték  2/3 . Vt Kav = 0 – 1 log M  Kav
BIOPOLIMEREK MOLEKULA TÖMEGÉNEK (MÉRETÉNEK) MEGHATÁROZÁSA GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL log M  Ve / V0 = Kav (Vt – V0) (Vt – V0) állandó érték  2/3 . Vt Kav = 0 – log M  Kav Determann egyenletek ( ) Dextrán (Sephadex) gélekre - fehérjékre, enzimekre Ve Vo logM = M0 - ( )  = a xerogél szemcse sűrűsége

26 MOLEKULA TÖMEG (MÉRET) MEGHATÁROZÁSA GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL

27 A gélkromatográfia térfogati paramétereinek összefüggése a diffúziós állandóval

28 A MOLEKULA TÖMEGÉNEK ÉS MÉRETÉNEK ÖSSZEFÜGGÉSE
A gélkromatográfia alkalmazására vonatkozóan hangsúlyozni kell a molekula tömegének és (virtuális) méretének összefüggését (eltérését), amely a molekula fajlagos parciális térfogatával és a Stokes-féle rádiusszal írható le: M – molekulatömeg, N – Avogadro-féle szám, a – Stokes-féle rádiusz, D – diffuziós állandó, υ – molekula fajlagos parciális térfogata, η – viszkozitási együttható.

29 A GÉLKROMATOGRÁFIA MÓDSZEREI ÉS ALKALMAZÁSI TERÜLETEI
PREPARATÍV (BATCH) MINTA ELŐKÉSZÍTÉS - ANALITIKAI OSZLOPKROMATOGRÁFIA (LC – HPLC) - RÉTEGKROMATOGRÁFIA BEKONCENTRÁLÁS SÓMENTESÍTÉS PUFFER CSERE CSOPORT FRAKCIONÁLÁS TISZTÍTÁS – ELVÁLASZTÁS MOLEKULA TÖMEG (MÉRET) MEGHATÁROZÁS DETERGENS GÉLKROMATOGRÁFIA KROMATOFOKUSZÁLÁS

30 MOLEKULA TÖMEG MEGHATÁROZÁS GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL

31 CSOPORT FRAKCIONÁLÁS GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL

32 POLIETILÉNEK (2-32 kDa) ÉS SZÉNHIDROGÉNEK (C5-C58) ELVÁLASZTÁSA MÉRET SZERINTI KIZÁRÓDÁSOS (SEC) GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL

33 TRANSZFERRIN TISZTÍTÁSA GÉLKROMATOGRÁFIÁVAL

34 HUMÁN SZÉRUM LIPO PROTEIN OSZTÁLYOK (SEM) CHYLOMICRON VLDL

35 A HUMÁN SZÉRUM LOW DENSITY LIPOPROTEIN (LDL) MOLEKULA DODEKAHEDRÁLIS (pentagon dodekaéder) MODELLJE

36 HUMÁN SZÉRUM LIPOPROTEIN OSZTÁLYOK ELOSZLÁSA
ELFO VLDL LDL HDL UC

37 HUMÁN SZÉRUM LIPOPROTEINEK ELVÁLASZTÁSA ELEKTROFORÉZISSEL AGARÓZ GÉLEN

38 SEC LDL HUMÁN SZÉRUM LIPOPROTEINEK ELVÁLASZTÁSA AGARÓZ (Sepharose 6B)
GÉLOSZLOPON VLDL HDL

39 Fehérje és lipid micellák
PLAZMA MEMBRÁN ÖSSZETEVŐK SZOLUBILIZÁLÁSA DETERGENSEKKEL (SDS - Na-dodecil szulfát) SDS (900 – 5 min) Detergens Sejtmembrán Fehérje és lipid micellák

40 - o - - X - - ● - Májsejtek plazma membrán fehérje és lipid tartalmának elválasztása detergens gélkromatográfiával Sepharose 4B oszlopon.

41