A DNS Szekvenálás 2008 Géntechnikák labor.

Az előadások a következő témára: "A DNS Szekvenálás 2008 Géntechnikák labor."— Előadás másolata:

1 A DNS Szekvenálás 2008 Géntechnikák labor

2 Bevezetés Restrikciós enzimek / restrikciós térképek Genom könyvtárak
Fehérje aminosavsorrend meghatározás Diagnosztika (genotipizálás, kezelés elbírálása, vakcinarezisztens mutánsok) Direkt szekvenálás Egyféle termék Klónozott PCR termék Többféle termék Egymásra rakódó szekvenciák Klónozás plazmidba

3 Módszerek Maxam-Gilbert-féle kémiai degradáció
5’ radioaktív izotópos jelölés (32P) Bázis specifikus hasító reakciók Elektroforézis, autoradiogramm Mérgező anyagok, négy reakció Sanger-féle enzimatikus módszer Automatizálható!!!!! Az eljárás közben nő a DNS mennyisége, tehát kisebb mennyiségű is kimutatható Egy reakcióban is megoldható Fluoreszcens molekulával jelölt primer, vagy didezoxinukleotidok PCR + Elektroforézis poliakrilamid gélben

4 A reakcióelegy: Templát Oligonukleotid primer DNS polimeráz
Dezoxinukleotidok (dATP,dCTP,dGTP,dTTP) Didezoxinukleotidok (ddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTP)

5 A szekvenálás Denaturáció Anelláció Elongáció
Egy primer Elongáció Véletlenszerű lánc termináció

6 A szekvenálás menete

7 Elválasztás Elektroforézis kapillárisban (375μm / 75μm)
Nagy felület-térfogat arány → nagy hőleadóképesség → nagyobb feszültségnél sem melegszik annyira Kis feszültség: szebb elválasztás Poliakrilamid mátrix Betöltés: nagynyomású nitrogén nagy felbontás Minta bejuttatása Elektrokinetikus injektálás Megfelelő neg. Ionok (DNS) legyenek csak! Ha eltömődik a kapilláris, leesik az áramerősség

8 Detektálás A jelölő molekulát lézerrel gerjesztjük, majd mérjük a fluoreszcenciát Fluoreszcensen jelölt primer Négy reakció Mindegyikben csak egy didezoxinukleotid Négy futtatás Fluoreszcensen jelölt didezoxinukleotidok Egy reakció Egy futtatás Minden ddNTP más hullámhosszon detektálható

9 Kiértékelés A jelekből egy szoftver kromatogrammot készít, a bázisokat eltérő színű csúcsok jelölik. Szekvencia ellenőrzés!!!!! Olvashatatlannak ítélt pozíciók N betűi Kiértékelési hibák Kimaradt betűk

10 Szekvenciák összehasonlítása
Fontos mindkét szálat megszekvenálni, és összehasonlítani az eredményeket. Összehasonlításhoz ingyenes internetes szoftverek. (Clustal, Multalin)

11 TTV típusok genomjának összehasonlítása (Multalin)

12 Irodalomjegyzék Berencsi György: Orvosi molekuláris virológia
Multalin ( )

13 Köszönöm a figyelmet!