Génexpresszió más (nem-E.coli) prokariótában

Az előadások a következő témára: "Génexpresszió más (nem-E.coli) prokariótában"— Előadás másolata:

1 Génexpresszió más (nem-E.coli) prokariótában
Bacillus subtilis elsőként (az E.coli után)

2 Miért termeltessünk heterológ fehérjét Bacillus subtilis-ban?
Sok fehérje kiválasztása a tápoldatba, nagy mennyiségben ! SZEKRÉCIÓ! 2) Nincs patogén törzs 3) Jól ismert, nagy térfogatú ipari fermentációk Hátrányok: 1) Korlátozott számú vektor 2) Az optimalizált vektor rendszerek védettek 3) Nem glikozilez 4) Sok proteáz – terméket tönkre teszi

3 Optimalizált B. subtilis “Cell Factory”?
A B. subtilis genom 12% -ának deléciója, nincs rá szükség a növekedéshez A felszabaduló energia a termék-képződésre fordítódhat. x x x x x

4 2) A Bacillus subtilis Sec-függő és Sec-független szekréciós útvonalai alaposan tanulmányozhatók és valószínűleg javíthatók is A szekréciós útvonal utolsó lépései problémásak, amelyek citoplazma membránon történő transzlokációt követik. a) A SipS (SPáz) túltermeltetése segít A későbbi proteolízis a fő probléma. A transzlokálódott fehérjék másodlagos szerkezete a sejtfal környezetben alakul aktívvá és proteáz rezisztenssé. b) ezt pl. a PrsA, a tiol-diszulfid reduktázok és kationok (pl. Ca2+ és Fe3+) katalizálják.

5 Néhány termék Enzimek Finom vegyszerek Poliszacharidok Proteázok
Amilázok Finom vegyszerek Aminosavak vitaminok Poliszacharidok hialuronsav

6 Az expressziós kazetta

7 Bacillus gazdák Bacillus subtilis Bacillus licheniformis Szekréció jó
amyE, nprE, aprE, spoIIAC, srfC deléciók Természetes kompetencia Bacillus licheniformis Kis extracelluláris proteáz aktivitás, spo Elektroporáció, konjugáció, protoplaszt

8 Géncsere

9

10

11

12

13 Törzsfejlesztés habzás
Surfactin: felületaktív lipopeptid

14 Pigment mentes törzs

15 Ilyen egyszerű a dolog? Valahol mindig van valami probléma

16 Transzkripciónál és az mRNS telítés

17 A termelő törzs: erős promóter és nagy kópiaszám (a régi módi)

18 Az mRNS telítés lehetőségei

19 Erősebb promóterek: a tandem promóter/cry3A stabilizáló technika

20 A termelő törzs (új megoldás)
Inzerció több, nem kapcsolt lókuszba 100%-os stabilitás mRNS telítés Marker mentes termelő törzs

21 Maximális termelés egy kópiás expressziós kazettáról

22 Hialuronsav termelés B. subtilis-szel

23 Hialuronsav termelés Streptococcus törzsekkel

24

25 Hialuronsav termelés B. subtilis-szel, mesterséges operon

26 Operon a kromoszómába

27

28 EUKARIÓTA expressziós rendszerek
Élesztő Baculovírus Emlős Posztszintetikus módosítások

29 Expresszó élesztőben Autonóm replikálódó vektorok -> shuttle vektorok

30 Integrációs vektorok jobb stabilitás, jobb termelés

31

32

33 Hatékony kiválasztás Ha toxikus a fehérje Ha S-S hidak kellenek
S. cerevisiae hiperglikozilál P. pastoris nem

34 P. pastoris

35

36

37 Rovar sejtben majdnem emlős minőség
Baculovírus Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis virus (AcMNPV)

38

39 EMLŐS sejt