NAGYHATÉKONYSÁGÚ FOLYADÉKKROMA-TOGRÁFIA = NAGYNYOMÁSÚ = HPLC

Az előadások a következő témára: "NAGYHATÉKONYSÁGÚ FOLYADÉKKROMA-TOGRÁFIA = NAGYNYOMÁSÚ = HPLC"— Előadás másolata:

1 NAGYHATÉKONYSÁGÚ FOLYADÉKKROMA-TOGRÁFIA = NAGYNYOMÁSÚ = HPLC
Az alkalmazott nagy nyomás ( bar) lehetővé teszi nagyon finom szemcsézetű töltetek (2-10 μm) használatát, ami jelentősen megnöveli a módszer felbontóképességét. A hagyományos oszloptechnikánál gyorsabb (kényszer áramlás), pontosabb és folyamatosan detektálható. A gázkromatográfiával szemben hőre érzékeny- és nem illó vegyületek esetében is használható. A mozgófázissal szelektív kölcsönhatások alakulnak ki.

2 HPLC FELÉPÍTÉSE

3 Ő építette meg az első nagynyomású folyadékkromatográfot.
Bár a szakirodalmi adatok szerint J. C. Giddings, Joseph F. K. Huber és Horváth Csaba egyaránt jelentős szerepet vállaltak - egymástól függetlenül - a HPLC kifejlesz-tésében és elterjesztésében, a HPLC atyjának mégis egyértelműen Hor-váth Csaba professzort ismeri el a szakma, mivel elsőként ő ismerte fel a HPLC egyedülálló jelentőségét a biokémia, a molekuláris biológia és a modern bioanalitika területein. A legelismertebb, az RP-HPLC-t meg-alapozó elméleti közleményére csak-nem ezer citálást kapott, ez az elvá-lasztástudomány legtöbbször idézett munkája. Horváth Csaba

4 OLDÓSZEREK Üveg, vagy műanyag edények.
Megfelelő tisztaság (oszlop védelme és a megfelelő detektálás érdekében!). Gázmentes. Eluensben oldott gázok és főleg az O2 eltá-volítása. Zavarja a pumpa egyenletes működését és a detektorban kis csúcsokat produkál. Gázmentesítés megvalósítása: - melegítés; - vákuum alkalmazása; - ultrahangos szonikálás (rázatás); - sparge = He gáz átbuborékoltatása folyamatosan (oldott gázokat kiűzi). Szűrés – üvegszűrő + vákuum alkalmazása.

5 SZIVATTYÚK Feladatuk: egyenletes, szabályozott folyadékáramlás
Mechanikus szivattyúk – állandó áramlási sebesség biztosítása. Két egymással szemben működtetett váltakozó mozgásirányú dugattyús szivattyúk (reciprok pumpák). Pulzáláscsillapító

6

7 Pulzáláscsillapító 1, tekercs - flexibilis
2, membrán – hexánnal töltve 1 2

8 Szivattyú után nagynyomású szűrő következik (2 μm-es saválló acél).
Nyomásmérő (jelzi, ha az oszlop eltömődik, vagy a szivattyú hibás). Összekötő csövek: saválló acél, vagy speciális műanyag 0,2-0,3 mm belső átmérővel. Minél rövidebb utak → kis holttérfogat (keverőedény effektus). GRADIENSKÉPZŐ Izokratikus elúció – változatlan összetételű mozgófázis Gradiens elúció – az eluens összetételének folyamatos (lineáris, exponenciális, vagy parabolikus), vagy ugrás-szerű változtatása. Alacsony nyomású keverő – pumpa előtti keverés Nagy nyomású keverő – pumpa után, oszlop előtti keverés

9

10 Mintainjektáló rendszer
Injektált mennyiség (analitikai): μl Fajtái: Injektálószelep - Rheodyne, cserélhető rögzített térfogatú hurkokkal (loop). Automata mintaadagoló Programozható mintamennyiség – motorizált fecskendő. Automatizált mérés (100 mérés/éjszaka).

11 Kézi injektálás

12 Automata mintaadagoló

13 OSZLOP Anyaga: saválló acél, vagy műanyag.
10 – 30 cm hosszú, d = 2-6 mm. Analitikai oszlop védelmének érdekében előtét oszlopot használunk (védő oszlop = guard column), mely azonos töltetű, mint az analitikai oszlop (1-5 cm). Töltetek szemcsemérete 2-10 μm, nagy fajlagos felület > 100 m2/g, nagy kapacitás és kellő szilárdság. Hatékonyan elválasztó oszlopot csak egyenletes kisátmé-rőjű, gömb alakú szemcsékből lehet készíteni. Minél kisebb a szemcseméret, annál nagyobb N (nagyobb a fajlagos felület), csökkentésének határt szab a növekvő nyomás, amit a megnövekedett oszlopellenállás produkál (sugárirányú hőmérséklet gradiens). Sugárirányú hőmérséklet gradiens= kromatográfiás entrópia effektus, mely a már elválasztott zónákat visszakeveri. Nagyon kicsi szemcsék a kohéziós erők miatt összeragadnak és így nagyobbként viselkednek. Alsó határ 1-2 um.

14

15 van Deemter görbék különböző szemcseméretű állófázisok esetén
Áramlási sebesség ml/min

16 NORMÁL FÁZISÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA
Állófázis: poláris, mechanikailag stabil. Szilikagél Aluminium-oxid Módosított szilikagél. Porózus anyagok. Szilikagélek átlagos pórus átmérője 6-20 nm (pl. 120 Å), ez red része a szemcseméretnek. Víz dezaktiválja a felületet. Fémszennyezések kerülése. Víz H hidakat képez az OH csoportokkal. Kationok polarizálják az OH csoportokat.

17 Szabad szilanol csoport (gyenge sav)
Módosítot szilikagél Szabad szilanol csoport (gyenge sav) Szubsztituált klórszilánnal módosítják. Felvitt csoportok: fenil, amino, diol, ciano. Poláris (dipol-dipol, dipol-indukált dipol) kölcsönhatás a vegyületek és az állófázis poláris csoportjai között (-OH, -NH2, -CN), ami retencióhoz vezet. Minél polárisabb egy vegyület, annál tovább tartózkodik az állófázisban, annál nagyobb retenciós ideje lesz. Phenyl Propylphenylsilane ligands attached to the silica gel show weak dipole - induced dipole interactions with polar analytes. Usually this type of bonded phase is used for group separations of complex mixtures. Amino-compounds show some specific interactions with phenyl modified adsorbent. CN A cyano modified surface is very slightly polar. Columns with this phase are useful for fast separations of mixtures consistingof very different components. These mixtures might show very broad range of retention times on the usual columns. Cyano-columns could be used on both normal- and reversed-phase modes of HPLC. NH2 Amino-phase is a weak anion-exchanger. This type of column is mainly used in normal-phase mode, especially for selective retention of aromatic compounds. Diol Diols are slightly polar adsorbent for normal-phase separations. These are useful for separation of complex mixtures of compounds with different polarity,  and which usually shows a strong retention on unmodified silica.

18 Módosítot szilikagél

19 φ = az oszlop porozitására jellemző tag dp = átlagos szemcseméret
Mozgófázis Apolárisabb, mint az állófázis (lsd. Eluotróp sorok). Oldószererősség. Minél apolárisabb egy oldószer annál kisebb az oldószererőssége, vagyis a visszatartás (retenciós idő) nagy. Általában szénhidrogének alkotják a mozgófá-zist, ehhez adunk 0,1-20 V/V% poláris oldószert, módosítót (pl. éter, észter, alkohol). Oszlop nyomása Δp = Lμηφ dp2 L = oszlop hossza μ = áramlási sebesség η = viszkozítás φ = az oszlop porozitására jellemző tag dp = átlagos szemcseméret

20 ALKALMAZÁSA Apoláris, vagy közepesen poláris izomer vegyületek elválasztása (szénhidrogénekben jól oldódjanak). Sztereoizomerek elválasztása – királis állófázissal Félpreparatív elválasztás – szerkezetazonosításra (hosszabb és nagyobb átmérőjű oszlopok)

21

22 FORDÍTOTT FÁZISÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA
Mozgófázis polárisabb, mint az állófázis Módosított szilikagél Szerves polimer alapú állófázisok Szén alapú állófázisok

23 Szabad szilanol csoport
Szilikagélt aklilcsoportokat tartalmazó klórszilánnal reagáltatjuk (mono-, di- és triklór-szilánnal). C18H37 Si CH3 OH O Cl + -HCl Savas hidrolízis helye Szabad szilanol csoport

24 Monofunkciós- és bifunkciós (pl. diklór-szilánnal) módosítás
monomer polimer Monofunkciós- és bifunkciós (pl. diklór-szilánnal) módosítás

25 A módosítás során a szilanolcsoportok 40-60%-a reagálat-lan marad.
Utóreakció során trimetil-klórszilánnal módosítanak. Endcapping = utóreakció (e) Használhatóság pH tartománya: 2 (alkil csoportok savas hidrolízise) < pH < 8-9 (szilikagél kioldódása). Újfajta oszlopok: pH = 10-11 Apoláris (diszperziós) kölcsönhatás a vegyületek és az állófázis apoláris csoportjai között (C4, C8, C18), ami retencióhoz vezet. Minél apolárisabb egy vegyület, annál tovább tartózkodik az állófázisban, annál nagyobb retenciós ideje lesz.

26 Oszlophossz (cm) Részecskeméret (μm) Tányérszám 1 10 3 11 111 2 5
10 526 15 13 636 4 25 15 625 10 280 2-4 hossz a 2,5x, míg az N 1,5x és a nyomás is a 2,5x és a retenciós idő is nő! gyökN a felbontás, 2x N növekedés csak 1,4x R növekedés The reason for that is the packing procedure. Columns are usually packed by forcing the slurry (suspension of the particles in specific solvent) through the column tube with only bottom endfitting with the frit installed. Average applied pressure usually 10,000 psi (600 bar) and it kept constant. At the beginning of the packing process slurry moves through the column very fast (constant pressure mode) and the flow is turbulent which ensure the formation of the dense uniform packing bed. While the process continues, the rising of the packing bed inside the column increase the resistance to the flow. Since we are using constant pressure, and we can not increase pressure any more, because porous silica particles are fragile, the flow rate decreases and it became laminar. The laminar flow will not form dense and uniform packing bed and the top of the column always packed slightly more lose than the bottom. The longer the column the more significant this effect.The optimum packing efficiency is considered to be between 2 to 2.5 particles per one theoretical plate.This means that we may expect the optimum efficiency for 3 m particles on the column of 10 cm and less, for 5 m particles it will be on the level of 15 cm, and 10 m particles could be used on 25 cm column.Further increase of the column length will give you a proportional rise of the backpressure but you won't gain much of the efficiency.

27 Mozgófázis Poláris, kis viszkozitású, jó UV áteresztőképességű, kevéssé illékony és toxikus oldószerek. Víz oldószer erőssége a legkisebb, alkalmazott szerves módosítok, melyek a retenciót csökkentik: metanol<acetonitril<eta-nol<tetrahidrofurán. Ionizálható minta esetén pH kontroll kell. Alkalmazott pufferek: foszfát/foszforsav, acetát/ecetsav, ammónia/ammónium-klorid. A puffer UV cut-off-ja kisebb mint a detektálási hullámhossz; Szilárd szennyező mentes (szűrni kell !!!); Adott pH-án mikroorganizmusok (alga, baktérium) képződése; Puffer kompatibilitás a szerves oldószerekkel (kicsapódik magas szerves oldószertartalomnál-szerves pufferek oldékonysága nagyobb); A minta stabilitása nagy legyen az adott pufferben; Puffer mentesítés (vízzel kezdjük majd szerves oldószerrel);

28 Funkciós csoportok polaritása:
C-H < C-O-C < C-N-C < CN < C=O < HO-C=O < OH Oldószer Oldószer erősség (ε) NORMÁL! Viszkozitás (cP) UV cut-off (nm) Hexán 0,33 200 Széntetraklorid 0,14 0,97 263 Kloroform 0,31 0,57 245 Diklórmetán 0,32 0,44 235 Tetrahidrofurán 0,35 0,55 215 Dietil-éter 0,29 0,23 Etilacetát 0,45 260 Dioxán 0,49 1,54 Acetonitril 0,50 0,37 190 2-propanol 0,63 2,3 210 Metanol 0,73 0,60 205 Víz >1,00 1 - 30% acetonitril = 50 % metanol lgk azonos We can say now that HPLC retention process has dual nature. First the analyte has to partition into the porous space, which has different eluent composition than the space around the particles. After the analyte had partitioned inside the pores it could get adsorbed on the surface of the stationary phase. This approach could explain some discrepancies in both existing theories of HPLC retention: adsorption and partitioning.

29 Izokratikus elválasztásnál a 4 oldószer módszere

30 Az analízis ideje lecsökken. A felbontóképesség javul.
Gradiens elució A módszer előnyei: Az analízis ideje lecsökken. A felbontóképesség javul. Keskenyebb csúcsok. Nagyobb érzékenység. Gradiens elució Izokratikus elució

31 Gradiens programozás

32 It was suggested that the behavior of the brush phase could be explained as a result of the free chains interacting with themselves in preference to interacting with the aqueous solvent. In effect, this was the same phenomena of immiscibility that occurs between water and a liquid hydrocarbon. The dispersive forces between the hydrocarbon chains themselves are greater than the forces between the hydrocarbon chains and the aqueous solvent. As a result the chains interact with themselves and collapse on the surface of the silica. When the methanol content of the mixture is increased, the solvent becomes more dispersive in nature and the hydrocarbon chains can then interact with the solvent and no longer exist in a collapsed state.

33 Szerves módosítok hatása fordított fázisú kromatográfiás rendszerekben
Termodinamikai leírása az adszorpciós jelenségeknek VR = vizsgált komponens retenciós térfogata V0 = holt térfogat G an. = vizsgált komponens adszorpciós energiája x = szerves módosító moltörtje G el. = eluens adszorpciós energiája (~ oldószererősség) Ha x nő →Vr csökken Víz nem vesz részt az adszorpcióban, csak a szerves módosító. A komponensek és a módosító vetélkednek az adszorpciós helyekért. Kiszorításos modell. 2% AcCN már teljesen borítja a fordított fázist.

34 Hidrofób rendszereknél! Retenciós térfogat / ml
This type of the influence of the mobile phase composition and its thermodynamic explanation are true for the chromatographic system with only hydrophobic interactions (dispersive forces). In case of the presence of any specific adsorption sites, the analyte behavior may significantly differ from that described above. Acetonitril v/v%-a vízben

35 Alkil-benzolok, alkil-fenonok és alkil-parabének visszatartás változása a szénatomszám függvényében
Based on this picture we can see that alkylbenzenes expose much stronger retention than phenones. Presence of carbonyl group in phenones molecules makes it more polar and thus reduces the strength of dispersive interactions with hydrophobic surface. Retention of alkylparabenes is the smallest in all three series. Parabenes is an esters of p-hydroxybenzoic acid. Nuclei of this homologous series are very polar and do not show any significant interaction with the surface. Szénatom szám

36 A pH szerepe az elválasztásban
Semleges vegyületek – nincs pH hatás Szénhidrogének, aromás szénhidrogének (PAH), halogénezett aromások (PCB), alkoholok, éterek, ketonok, aldehidek. Savak és bázisok – pH változás hatására ionizálodnak Ionos vegyületek – pH és puffer hatása 2. és 3. esetben a megoldás: pH kontroll → szupresszió, ionos állapot visszaszorítása. Ionpárképzés Ioncsere kromatográfia

37 Savas csoportot tartalmazó szerves vegyületek visszatartás változása a pH függvényében
RCOOH RCOO-/RCOOH B szakaszban legnagyobb a csúcsszélesedés pka alatt és felett 2 egységgel jó dolgozni ez 1/99 és 99/1 arány. Effects in region A b.         Acidic analytes show extremely long retention times (analyte in its neutral form.) Effects in region B Let us assume that neutral molecules will be retained, so during the run ions will move faster, and at the first moment they will be separated from the neutral molecules. But, according to the above equilibrium, in the absence of the neutral molecules ions will tend to form them, and this new neutral molecule will also be absorbed, and so on. This process will lead to the spreading of the component along the column and causes the appearance of the broad peak. a.         Significant loss of apparent efficiency for both, acidic and basic analytes. Peaks are broad and sometimes have weird shape, but mostly tailing or fronting. b.         Very unstable retention. Minor changes in pH or composition of the mobile phase will significantly shift retention. c.         Minor changes of the eluent composition can cause significant change in selectivity. Effects in region C b.         Silica is soluble at high pH. If the column has some accessible silanols (which all columns usually do) high pH may cause steady degradation of the packing material. This brings a loss of the efficiency due to the formation of the void volume, or steady change of component retention. c.         If the mixture of analytes contain s some acidic components, these components will be in anionic form at high pH. Organic analytes in their anionic form usually are strongly solvated and may be completely excluded from the pore space of the packing material. This cause very early elution usually not adjustable by the element composition. pKa RCOO-

38 A pH és módosító hatása savas vegyület elválasztására
Lauric acid, or dodecanoic acid, is a saturated fatty acid with the structural formula CH3(CH2)10COOH . It is the main acid in coconut oil and in palm kernel oil, and is believed to have antimicrobial properties. It is also found in human milk(5.8% of total fat), cows milk(2.2%), and goat milk(4.5%). It is a white, powdery solid with a faint odor of bay oil or soap. Lauric acid, although slightly irritating to mucous membranes, has a very low toxicity and so is used in many soaps and shampoos. Sodium lauryl sulfate is the most common lauric-acid derived compound used for this purpose. Because lauric acid has a non-polar hydrocarbon tail and a polar carboxylic acid head, it can interact with polar solvents (the most important being water) as well as fats, allowing water to dissolve fats. This accounts for the abilities of shampoos to remove grease from hair. tailing

39 Bázikus csoportot tartalmazó szerves vegyületek visszatartás változása a pH függvényében
R-NH2 R-NH3+/R-NH2 Effects in region A a.         Basic analytes show relatively low retention (analyte in its ionic form). Effects in region B a.         Significant loss of apparent efficiency for both, acidic and basic analytes. Peaks are broad and sometimes have weird shape, but mostly tailing or fronting. b.         Very unstable retention. Minor changes in pH or composition of the mobile phase will significantly shift retention. c.         Minor changes of the eluent composition can cause significant change in selectivity. Effects in region C a.         Very long retention for basic analytes, thus require working with high organic concentration of the mobile phase where pH adjustment is inefficient. pKb R-NH3+

40 A pH hatása bázikus vegyületek elválasztására
Bázikus antihisztaminok pH=11 !!!)

41 Fordított fázisú ionpár-kromatográfia (RP-IP-HPLC)
A retenció növelése érdekében az eluensbe mmol/L ionpárképző, hidrofób iont teszünk (felületaktív anyagok), melynek töltése ellentétes a meghatározandó anyagéval. Anionos ionpárképző Kationos ionpárképző Alkil-szulfonsavak Tetrabutil-ammónium sók D- és L- kámfor szulfonát Cetil-trimetil-ammónium sók Alkil-szulfátok Dodecil-oktil-dimetil-ammónium sók

42 Kationos ionpárképző és az állófázis elhelyezkedése
C18 állófázis N+ [Molekula ION]-

43 Az RP-IP-HPLC-ben fontos paraméterek
Ionpárképző koncentrációja (c nő → k nő). Ionpárképző jellege (lánc hossz nő → k nő, egyenes lánc – elágazó lánc). Szerves módosító típusa és mennyisége. Puffer koncentrációja, pH-ja (ionos állapot biztosítása). Idegen só koncentrációja.

44 A hőmérséklet hatása az elválasztásra
At the elevated temperature viscosity of liquids decrease and diffusion coefficient increase, thus, from the Van Deemter equation the second term will increase which will lead to the decrease of the efficiency at the very low flow rates (which is not important). The last term will decrease which will lead to the increasing of the efficiency at the common flow rates and it also widen the flow rate range with optimum efficiency. H = 2 λdp + 2γDm k df2 u u π2 (1+k)2 Ds

45 DETEKTOROK A detektor feladata a kiáramló eluensben mérni az összetevő pillanatnyi koncentrációját. A közvetlenül mért detektorjel általában nem maga a koncentráció, hanem annak valamilyen függvénye. Detektor típusok Ultraibolya/ látható fény (UV/VIS), LOD: ~ g Fluoreszcenciás, LOD: g Vezetőképességi , LOD: 10-9 g Törésmutató különbség mérése (RI), LOD: 10-8 g Fényszórásmérésen alapuló (ELS), LOD: 10-8 g Tömegszelektív (LC/MS), LOD: 10-15

46 Detektorok tulajdonságai
Alacsony zajszint és stabil alapvonal (low drift). Megfelelő érzékenység. Gyors jelképzés (12 pont/csúcs). Széles linearitási tartomány. Alacsony holttérfogat (csúcsszélesedés minimalizálása). Könnyen kezelhető és megbízható. Működési körülmények optimalizálhatósága. Dinamikus tartomány (koncentráció változás-jel változást idéz elő) Lineáris tartomány (egységnyi koncentráció változás-állandó jel változást idéz elő) Szelektivitás Érzékenység

47 Az elektronpályák relatív energiái és az elektrongerjesztések típusai
Szigma-szigma lazító csak CH-k Távoli UV Pi-pi lazító,2-ös,3-as kötések, aromás UV és látható fény Nemkötő – pi lazító Heteroatom+ 2-ös kőtés UV és látható Nemkötő- szigma lazító heteroatomok és telített, 200 nm

48 Spektrofotometriás detektorok Lambert- Beer törvény:
Ezek az eluátum fényelnyelését mérik. Az ultraibolya, eset-leg az ultraibolya és a látható fény tartományban működnek. Lambert- Beer törvény: A = lg (Io/I) = ε×c×l Io = a megvilágító fény intenzítása I = fényintenzítás az abszorpció után c = koncentráció ε = abszorpciós együttható l = optikai úthossz

49 Spektrofotometriás detektorok típusai
1, Higanygőzlámpa, 254 nm, monokromatikus fény, (aromás rendszerek).

50 Átfolyó cella UV/VIS detektálásnál
A kék szín az áramló eluátumot jelzi, a küvetta két ablakát zölddel jelöltük (de a valóságban természetesen színtelen , hiszen kvarcból készül). A fény-nyaláb vízszintesen megy át az ábra középtengelyében. A fényút hossza a két ablak között tipikusan 1 cm, ennek a térrésznek a térfogata néhány mikroliter (v.ö. a csúcsok kb. 100 mikroliteres szélességével). Ideális a 10 mikroliter. Apparent Peak broadening   happens if the flow cell volume is more then 1/10 of the peak volume, or if the cell geometry is not optimized.

51 Funkciós csoportok moláris abszorbciós koefficiense
Név Kromofor csoport Hullámhossz [nm] e Aldehid -CHO 210 1,500 Amin -NH2 195 2,800 Azo -N=N- 3-25 Bromid -Br 208 300 Karboxil -COOH Diszulfid -S-S- 194 5,500 Észter -COOR 205 50 Éter -O- 185 1,000 Keton >C=O Nitrát -ONO2 270 12 Nitril -C=N 160 - Nitrit -ONO nitro -NO2 1500

52 Több csatornás a, diszperziós – diszperziós ráccsal mono-kromatikus fény előállítása a cella előtt. benzol

53 b, diódasoros (PDA) – széleskörben elterjedt.
A diódasoros detektorok lehetővé teszik a teljes spektrum felvételét igen gyors egymásutánban. Ezekben a küvettát polikromatikus fénnyel világítják át és a felbontás a küvetta után történik. A szétterült fénnyalábot egy (fotó)-diódasorra vetítik. A 200 nm széles analitikai UV tartomány befogadásához diódából álló sor szükséges (felbontás 1-2 nm). A diódasoros detektor segít a csúcsok azonosításában és tisztaságuk ellenőrzésében, mert koelució esetén a csúcs lefutása közben a spektrum alakja változik, míg egyetlen anyag csúcsa esetén a spektrum alakja állandó, csak a magassága változik.

54 PDA detektor Deutérium lámpa tükör erősítő fotódiódasor Átfolyó cella
Optikai rács

55 A és B vegyületek UV spektruma és két eltérő hullámhosszon
felvett kromatogramja. Aλ1 = állandó viszonyszám Aλ2 Csúcstisztaság jellemzése.

56 A klórtalidon gyógyszer tisztaság vizsgálata

57 5 % terc-butil-benzol szennyezés kimutatása antracénban

58 Csúcstisztaság vizsgálat PDA detektorral
b

59 Fluoreszcenciás detektor
Szelektív, mert a szokványos szerves vegyületek közül viszonylag kevés mutat számottevő fluoreszcenciát. Kettős „hangolás” : változtatni lehet a besugárzó fény (UV tartományban) - és a kisugárzott, fluoreszcens, fény hullámhosszát (UV/látható tartományban). Gerjesztési spektrum (excitation) Emissziós spektrum (emission) nyerhető.

60 Az átfolyó küvettát itt is egy szűk fénynyalábbal világítják meg és a beeső fényre merőleges irányból történik a detektálás. A detektált fény intenzitása a fluoreszkáló komponens koncentrációjá-val egyenesen arányos. Ez a detektor nagyságrendekkel kisebb koncentrációk mérésére alkalmas, mint az UV detektor (10-12g/anyag).

61 Gerjesztési hullámhossz

62 3D fluoreszcenciás spektruma a Balti tengeri kőolajnak

63 Fluoreszcenciás detektor felépítése

64 AlKALMAZÁS Természetesen fluoreszkáló vegyületek (merev szerkezetű aromás vegyületek, porfin vázas vegyületek, riboflavinok, vitaminok, gyógyszerek). Származékkészítési reakciók alkalmazása fluoreszkáló vegyületek előállítására (OPA + tiol, FMOC, Fluoreszkamin, stb.). OPA + tiol FMOC 9-fluorenil-metil-kloroformát FMOC

65

66 λex λem 280 nm 340 nm 290 nm 320 nm 250 nm 385 nm 260 nm 420 nm 265 nm
Idő (s)         λex      λem                  0            280 nm          340 nm              220            290 nm          320 nm              340            250 nm          385 nm              510            260 nm          420 nm              720            265 nm          380 nm            1050          430 nm

67 Vezetőképességi detektor
Elektromos vezetést mérő (konduktometriás) de-tektor. HPLC detektálásra elsősorban az ionkromatog-ráfiában jön szóba. Konduktometriásan jól lehet mérni az eluátum-ban, mert könnyű kis térfogatú mérőcellát építeni, a műszer egyszerű, a jel a mérendő koncentráci-óval egyenesen arányos és a detektor csak az ionos összetevőket méri.

68 Refraktív index (törésmutató) detektor
Univerzális detektor, de csak akkor alkalmazható, ha az elválasztott komponensek törésmutatója eltér az eluens törésmutatójától. Gradiens elúcióval nem kompatibilis (0,1% eluens összetétel változás már a törésmutató változását idézheti elő). Hőmérséklet változás (0,001C –ra termosztáljuk). Pumpa pulzálás kontroll. Az oldatok törésmutatója általában eltér a tiszta oldószerétől és az eltérés a koncentrációval lineárisan változik. A változások általában kicsik, ezért csak viszonylag nagyobb koncentrációk (mM tájékán) mérhetők. A törésmutató nagyfokú hőmérsékletfüggése miatt a mérést a cella és a rajta átfolyó oldat pontos termosztálásával és differenciál-mérésként (a tiszta eluenssel szemben mérve) végzik. Ez a detektálás fontos például élelmiszerek, üdítő italok cukor jellegű összetevőinek mérésére. Ezek az anyagok nem nyelnek el az UV-VIS tartományban, a koncentrációjuk az élelmiszerekben pedig elég nagy a méréshez.

69

70 Fényszórás detektor ELS (evaporative light scattering detector)
Porlasztás: Nitrogén gáz segítségével az oszlopot elhagyó eluenst elporlasztjuk. Mozgó fázis elpárologtatása: Egy fűtött csőben áramoltatjuk át, ahol az oldószer elpárolog. Detektálás: A száraz minta részecskéket lézer fénnyel világítjuk meg egy átfolyó cellában. A részecskék által szórt fényt detektáljuk. A detektált fény arányos a részecskék számával (koncentrációjával). Univerzális, tömeg detektor.

71 The eluent is atomized in a stream of nitrogen and the finely divided spray passes down a heated chamber during which time the solvent is evaporated. The removal of the solvent produces a stream of particles which then pass through a collimated beam of light. The scattered light at an angle(45 fok) to the incident light is focused onto a photomultiplier tube and the output is processed in an appropriate manner electronically.

72

73 ELS detektor alkalmazása Lipidek zsírsavak cukrok tenzidek polimerek
aminosavak The device is fairly compact and relatively simple to operate. An example of the results obtained when used for monitoring a general lipid class analysis is shown in figure 50. The minimum detectable mass estimated from this chromatogram appeared to be about 10 ng of solute. To some extent, this detector provides a replacement for the transport detector as it detects all substances irrespective of their optical or electrical properties.

74 Az ACQUITY UPLC oszlopok Bridged Ethyl Hybrid (BEH) töltete

75 Fájdalomcsillapítók gyors elválasztása Oszlop: ACQUITY UPLC BEH 2,1x50 mm, 1,7 µm, 1ml/min Komponensek: 1. acetaminofen, 2. 2-acetamidofenol, 3. koffein, 4. acetanilid, 5. acetil-szalicilsav, 6. szalicilsav, 7. fenacetin

76

77