Enterobaktériumok, Coliformok, E. coli, és Salmonella kimutatása

Az előadások a következő témára: "Enterobaktériumok, Coliformok, E. coli, és Salmonella kimutatása"— Előadás másolata:

1 Enterobaktériumok, Coliformok, E. coli, és Salmonella kimutatása
3. gyakorlat

2 Indikátor mikrobák Enterobacteriaceae család (bélbaktériumok)
Coliformok Escherichia coli Salmonellák

3 Enterobaktériumok Indikátor baktériumok, jelenlétük fekáliás szennyeződésre utal. Előfordulás: emberi és állati béltraktus, felszíni vizek, talajflóra Jellemzőik:, Gr-, rövid pálcák, általában peritrich csillóval mozognak, fakultatív anaerobok oxidáz negatívak NO3→NO2-vé redukálják glükózt bontják sav (esetleg gáz) termelés mellett

4 Enterobaktériumok kimutatása
Lemezöntés: VRBG-agar, (hagyományos lemezöntés + fedőréteg 4 ml) kristályibolya-neutrálvörös-epe-glükóz, 37oC, 24 óra értékelés: 0,5 mm-nél nagyobb, ált. 2-3 mm-es, kerek, sötétvörös, csapadékkal körülvett (epesavas sók kicsapódnak, Na-dezoxikolát, Na-taurokolát) telepek Folyékony: BBG-leves: brillantzöld-glükóz-epe leves, 37oC, 24 óra értékelés: zavaros és kisárgul → VRBG agarra

5 VRBG

6 OXIDÁZ-próba 1%-os parafenilén-diamin-oldat negatív: sárgás
pozitív: kékes Pár másodperc - perc, A vas katalizálja! (üvegbottal, műanyag kaccsal végezhető) Enterobaktériumok: negatív

7 FERMENTÁCIÓS próba Szőlőcukros magas agar (egy telepet leszúrunk), 37 oC, 24 óra pozitív: sárga, gázt termel Enterobaktériumok: az eredetileg piros színű agar főleg az alján sárgul ki (fak. anaerob), és homogén (mert mozog a szúrási csatornából) s

8 Szőlőcukros magasagar

9 KATALÁZ próba 1 kacsnyi telep + pár csepp 10%-os H2O2 tárgylemezen → +: pezseg Enterobaktériumok: pozitív

10 Coliformok Laktózt 30°C-on egyidejű sav és gáz termelés mellett bontják Escherichia (E. coli), Klebsiella (K. oxytoca), Citrobacter (C. freundii), Enterobacter (E. aerogenes) nemzetség Gr-, vaskos pálcák, epét vagy epesót tartalmazó táptalajban 30°C hőmérsékleten sav- és gázképződéssel bontják a laktózt, Többnyire a normál bélflóra tagjai, de van kivétel is (pl. E. aerogenes, amely soha nem fordul elő a bélben) Jelenlétük a friss fekáliás szennyeződést valószínűsíti

11 Klebsiella

12 Coliformok kimutatása
VRBL táptalaj (kristályibolya-neutrálvörös-laktóz-epe) gátlóanyag: kristályibolya, Na-dezoxikolát savtermelés → neutrálvörös → piros, precipitációs udvar, min. 1 mm 0,5 mm átmérőjű, sötétpiros (lilás-vörös) telepek Endo agar gátlóanyag: Na-szulfit, fukszin laktóz→savak, aldehidek→aldehid+fukszin-szulfit → felszabadul a fukszin → vörös telepek (E. coli esetében ez olyan intenzív, hogy a fukszin kikristályosodik → fémes zöld fukszin-fény)

13 VRB agar

14 Endo agar

15 Coliformok kimutatása
BBL leves (brillantzöld-laktóz-epe leves), Durham cső, 30°C, óra, zavarosodás+1/10 gáz → Coliform gyanús Laurilszulfát-laktóz-leves gátlóanyag: Na-lauril-szulfát Durham cső, 30°C, 48 óra → 1/10 gáz X-leves (szintetikus táptalaj) ammóniumsó, laktóz, puffer, nyomelemek

16

17 Kromogén Coliform agarok

18 Escherichia coli Csak a bélcsatornában él, jelenléte mindig friss fekáliás kontaminációt jelez (index mikroba) Önmagában többnyire ártalmatlan, vagy hasznos, egyes törzsei kórokozók (pl. E.coli O157 H7) Kimutatása során el kell különíteni a Coliformoktól

19

20 IMV(E)C próbák Eijkman-próba: tenyészetből 1 kacsnyit BBL-levesbe → 44,5°C 48 óráig vízfürdőben inkubáljuk → gyanús: zavaros + 1/10 gáz Durham csőben → VRBL agar → nutritív agarra szélesztjük az E. coli gyanús piros 2 mm átmérőjű telepet, és ezekkel végezzük el az IMVEC próbákat

21 IMV(E)C próbák Indolképzési próba: TRIPTONVÍZbe oltunk, 24 óra 44,5°C inkubáció 0,5 ml KOVÁCS-reagens (p-dimetil-amino-benzaldehid amil-alkoholos sósavval savanyított oldata) 1 perc: + felszínen meggypiros gyűrű Triptofán + víz → piroszőlősav + indol → +KOVÁCS-reagens → ROZINDOL festék

22

23 IMV(E)C próbák Metilvörös próba: PUFFEROLT GLÜKÓZLEVES, 24 óra 37°C inkubáció 1-2 csepp METILVÖRÖS reagens +: az egész leves színe élénkpiros –: az egész leves színe sárga A kevertsavas, és a butándiolos erjesztést végző baktériumokat különíti el egymástól (E.coli kevertsavas erjesztést végez)

24

25 IMV(E)C próbák VP próba: PUFFEROLT GLÜKÓZLEVES, 24 óra, 37°C inkubáció
0,2 ml 5%-os alkoholos naftol-oldat 0,1 ml 40%-os KOH 2 csepp 0.5%-os kreatin-oldat 2 óra múlva +: tenyészet felső része piros A glükózt butándiolosan erjesztő baktériumok kimutatására szolgál.

26 IMV(E)C próbák ↓ O2, KOH ↓ +kreatin VP-próba
Glükóz → acetil-metil karbinol (acetoin) [ez a butándiolos erjedés egy köztes terméke] ↓ O2, KOH diacetil ↓ +kreatin piros szín

27 IMV(E)C próbák Citráthasznosítási próba: ALAPLEVES, 4-6 óra inkubáció, 37°C-on, majd oltótűvel CITRÁTOS magas-ferde agarba szúrunk és a felületén is szélesztünk → óra, 37°C inkubáció→ +: eredeti zöld KÉK-re vált -: eredeti zöld szín marad, nincs baktérium-növekedés (Brómtimolkék pH=6,8-on zöld, pH=7,6-on kék)

28

29 Az IMV(E)C próbák értékelése
Indol-képzés Metilvörös-próba Voges-Proskauer-próba Citrát-hasznosítás ELBÍRÁLÁS + - Fekáltípusú E. coli Atípusos Citrobacter típusos Citrobacter atípusos Klebsiella v. Enterobacter Enterobacter atípusos

30 β-D-glükuronidáz pozitív Escherichia coli kimutatása
β-D-glükuronidáz enzim kimutatása MUG-al MUG ( 4-metil-umbelliferil-D glükuronid): umbelliferil → β-D-glükuronidáz → umbelliferon (fluoreszkál) β-D-glükuronidáz enzime csak az E. colinak van (néhány Salmonella és Shigella törzstől eltekintve), a fluoreszcencia így nagy valószínűséggel E. coli jelenlétére utal. (E. coli O157:H7 nem képes ilyen enzimet termelni!) E. coli MPN: laurilszulfát leves + MUG

31

32 β-glükuronidáz-pozitív E. coli számának meghatározása
Minta (10 g/ml) + peptonvíz (90 ml), hígítási sor TBX (tripton-epe-glükuronid) agar lemezöntés (1 ml) Inkubálás 44± 1 oC óra Pozitív telep: kék További megerősítő vizsgálatok nem szükségesek!

33 Salmonella Enterobacteriaceae család Gram -, nem spórás
Önálló mozgásra képes, peritrich csillós kivétel: S. Gallinarum, S. Pullorum, S. Typhi 1 faj (Salmonella enterica), a szerotípusokat így írjuk: S. Enteritidis, S. Senftenberg, S. Typhimurium, S. Infantis, stb. (nagybetű, nem dőlt!!) Fakultatív anaerob Laktózt nem bontja, de Salmonella subgenus III (Arizona)-ba tartozó törzsek laktóz +, ONPG + Salmonella subgenus II-be tartozó törzsek között laktóz -, ONPG +

34

35 Általános tulajdonságok
Növekedés: 7-49,5°C, optimum: 35-37°C pH=3,8-9,5, optimum pH=7-7,5 Ellenálló képesség: Fagyasztástól nem pusztul el Alacsony vízaktivitás mellett (pl.: csokoládé: aw=0,3-0,5) sokáig (hónapokig) túlél, és megnő a hőtűrő-képessége Az alacsony pH-t kevésbé bírja, mint az E. coli D idők: 60°C-on 2-6 perc 70°C-on <1 perc (alacsony vízaktivitáson extrém hosszú túlélés: D-idő 70°C-on 1050 perc) 0,1% ecetsav (pH=5,1) jelenlétében a növekedése gátolt

36 Salmonellák kimutatása
A Bizottság /EK rendelete az élelmiszerek mikrobiológiai kritériumairól Kimutatási protokoll: MSZ EN ISO 6579 szerint Mintavétel: 25 g (vagy egyes esetekben 10 g) minta 100 cm2 lemosásával vagy ismert mennyiségű öblítőfolyadék Minta előkészítése: homogenizálni, majd azonnal leoltani. Szükség esetén 0-5°C-on 1 órát lehet várakozni.

37 Tenyésztési protokoll: Elődúsítással kombinált dúsítás I.
25 g vizsgálati anyag ml előmelegített pufferolt peptonvíz ↓ H O M O G É N E Z É S 18±2 óra 37±1°C (elődúsítás) 0,1 ml ml ↓ ↓ +10 ml RVS dúsító ml MKTTn dúsító 24±3 óra 41,5±1°C 24±3 óra 37±1°C

38 Tenyésztési protokoll: Elődúsítással kombinált dúsítás II.
↓ ↓ ↓ ↓ XLD Másik táptalaj XLD Másik táptalaj 24±3 óra 37±1°C ±3 óra 37±1°C Jellemző telepek kiválasztása ↓ Kioltás nem szelektív tápagarra (24±3 óra 37±1°C) Biokémiai próbák Szerológiai próbák

39 Dúsítók RVS: Rappaport-Vassiliadis dúsító
Malachitzöld, Mg-klorid, NaCl, K-dihidrogén-foszfát, pH=5,2±0,2 MKTTn: Müller-Kauffmann-tetrationát-novobiocin Na-tioszulfát, marhaepe, brillantzöld, lugol-oldat, CaCO3, novobiocin, pH=8,2±0,2 Régen használatban volt még: Bierbrauer-féle leves: Na-tioszulfát, lugol-oldat, marhaepe, CaCO3, malachitzöld, brillantzöld Szelenit-cisztin leves: Na-szelenit, laktóz

40 Szilárd táptalajok - XLD
XLD agar: Xilóz-lizin-dezoxikolát agar xilóz, laktóz, szacharóz (egyiket sem bontja!), L-lizin-hidroklorid, Na-tioszulfát, ammónium-vas(III)-citrát, Na-dezoxikolát (eredetileg vörös színű a táptalaj) Xilóz, laktóz, szacharóz savvá bontása → sárga szín H2S képződése → vas-szulfid → fekete szín Lizin → kadaverin (dekarboxilálás) → telepek körül bíbor szín (pH-változás) Na-dezoxikolát: Proteus telepek rajzásának gátlása, Gram+-okat gátolja Salmonella: telepek színe azonos a táptalaj színével (vöröses-bíbor), gyakran fekete középpel

41

42 XLD

43 Egyéb szilárd táptalajok
BPL agar: Brillantzöld-fenolvörös-laktóz agar lila, apró telepek, mivel pH nő (savra sárgulna) Brillantzöld gátolja a Gram+-okat, a S. Typhi-t és a Shigellákat BPLS agar: Brillantzöld-fenolvörös-laktóz-szacharóz agar Sem a laktózt, sem a szacharózt nem bontja, így liláspiros telepeket képez. A laktóz negatív, de szacharóz pozitív zavaró flórát lehet vele kiszűrni. Drigalski agar: sötétkék telep, mert Salmonella laktózból nem termel savat, sőt fehérjebontás miatt a pH megemelkedik Rambach agar: propilénglikol bontás, telep piros (savképzés - neutrálvörös indikátor), egyes estekben színtelen: S. Typhi, S. Paratyphi A, S. Typhisuis, S. Gallinarum SS agar: Salmonella-Shigella agar laktóz, marhaepe, Na-tioszulfát, Na-citrát, ammónium-vas(III)-citrát, brillantzöld, neutrálvörös Szulfidképződés → fekete közepe lesz a telepeknek Laktózt nem bontja → vörös marad a táptalaj

44 BPLS

45 Az MSRV agar MSRV agar: Modified Semi-solid Rappaport-Vassiliadis agar
A kimutatás a Salmonellák mozgékonyságán alapul: a Salmonella-migráció a félfolyékony tápközegben opálos udvaros növekedést eredményez. Nagy háttérfertőzöttségű minták esetén (pl.: bélsár-minta, cloaca-tampon) a dúsítási folyamatban az RVS dúsító helyett használatos. Ilyenkor a dúsítás végén a rajzás széléről kell továbboltani.

46

47 Biokémiai megerősítés
TSI ferde agar: Triple-sugar-iron agar 10g laktóz, 10g szacharóz, 1g glükóz, Fe-citrát, Na-tioszulfát, fenolvörös 1. Glükóz bontás: (TSI) savképzéssel + sav és gáz + 2. Laktózbontás: - , (TSI) Salmonella enterica subsp. arizonae: + vagy – laktózbontás 3. Szacharóz bontás: - (TSI) 4. H2S termelés: +, (TSI)

48 Biokémiai megerősítés
RÖVID BIOKÉMIAI SOR 1. Glükóz bontás: + 2. Laktózbontás: általában - 3. Szacharóz bontás: - 4. H2S termelés: + 5. Karbamid bontás: - 6. Indolképzés: - 7. Lizin-dekarboxilálás: + 8. Voges-Proskauer próba: - 9. ONPG-reakció: általában -

49 TSI agar TSI alja sárga: glükóz pozitív TSI teteje piros:
laktóz és szacharóz negatív Fekete foltok a TSI agarban: H2S-termelés

50 Biokémiai próbák 5. Ureáz-próba: (Karbamid bontás) -
(karbamid leves, 37°C, óra) értékelés: karbamid bontás esetén a felszabaduló NH3 a fenolvörös indikátor színét rózsaszínre, később lilára változtatja

51 Biokémiai próbák 6. Indolképzés: -
(triptonvíz, 37°C, óra, Kovács-reagens) értékelés: - sárga

52 Biokémiai próbák 7. Lizin-dekarboxilálás: +
(lizin leves, 37°C, óra) értékelés: + zavaros, bíborlila (brómkrezol-bíbor), (- : sárga lenne)

53 Biokémiai próbák Karbamidbontás: negatív Lizin-dekarboxiláz: pozitív

54 Biokémiai megerősítés
8. Voges-Proskauer próba: -, CH3 CH3 CH-OH %-os KOH C=O C=O α-naftol, kreatinin C=O acetoin diacetil (piros) 9. ONPG-reakció (o-nitrofenil β-D-galaktopiranozid) : - VP

55 Laktóz bontás Laktáz (β-galaktozidáz) enzim laktóz bontása

56 ONPG reakció (0,25 ml fiz. só, toluol, ONPG korong, 37°C, pár perc)
értékelés: - nincs színváltozás, (+: sárga lenne) Salmonella enterica subsp. arizonae: ONPG+

57 Szerológiai azonosítás
Önagglutináció kizárása: 1 csepp fiziológiás konyhasó oldat + kacsnyi törzs 1 perc múlva nagyítóval vizsgáljuk az agglutinációt, Ha pozitív: szerológiai azonosítás nem lehetséges

58 Szerológiai azonosítás
O-antigén: anti-O szérum konyhasóoldatban (szomatikus antigén) Vi-antigén: anti-Vi szérum konyhasóoldatban (fehérje jellegű burok-antigén, az egész baktériumot beburkolja) H-antigén: anti-H szérum (H-flagellar),

59 Az eredmények értékelése
Biokémiai próbák Ön-agglutináció Szerológiai próbák Eredmény Jellemző - O-, Vi- vagy H-Ag pozitív Salmonella Mindegyik negatív Feltehetően Salmonella + Önagglutináció miatt nem alkalmas vizsgálatra Nem jellemző -/+ Nem Salmonella

60 Pozitivitás esetén Döntő szerológiai azonosítás:
A Salmonella vagy feltehetően Salmonella törzseket megerősítésre vagy szerotípus meghatározásra a Nemzeti Salmonella Központba (Országos Epidemiológiai Központ) vagy a Salmonella Referencia Központba (MGSZH) kell küldeni.

61 Salmonella bakteriofág

62 Fág-tipizálás