szintű vizsgálat össze- Hasonlítása - glomerulus

Az előadások a következő témára: "szintű vizsgálat össze- Hasonlítása - glomerulus"— Előadás másolata:

1 szintű vizsgálat össze- Hasonlítása - glomerulus
Sztereomikroszkópos, FM, SEM és TEM szintű vizsgálat össze- Hasonlítása - glomerulus TEM és FM, símaizomsejt thrombospondin tartalom ER-ben Bombix mori csáp km. a: konvencionális b: kriofixálás c: freeze-substitution

2 STEM – EELS anyagszerkezeti alkalmazás

3 Növényi elektronmikroszkópos technikák
1. Áttekintés 1.1. Az EM munka célja 1.2. Feltételei 1.3. Lehetőségei 1.4. Korlátai 1.4.1 Felbontás - mélységélesség 1.4.2 Felhasználhatóság - alkalmazhatóság 1.4.3 Hibái – műtermékek 1.4.4 Költség, idő 1.5 Az EM, mint módszer értékelése

4 2. Konvencionális minta-előkészítés TEM-re
2.1 Főbb lépések: mintavétel FM fixálás víztelenítés átitatás beágyazás – minta blokkban kés grid ultramikrotóm (hártya) metszés FM festés TEM VIZSGÁLAT EREDMÉNY „processing”

5 1947, in vitro tenyésztett sejt
széli régiója patkány mirigyes szövet A:1956 B:1962 – minőségi változás jelentős

6 2.2 Történetiség 2.2.1 Műszaki fejlődés 2.2.2 Tudományos fejlődés  3. Mintavétel 3.1 A minta kiválasztása 3.2 Mintaszám 3.3 Minták kezelése 3.3.1 Manuális munka 3.3.2 Dokumentálás – fixálási napló 4. Fixálás: life-like state /változás minimalizálása/ Fixálás jó: minta olyan, mint FM-ben /félvékony metszeten/ ha strukturális sérülés nincs ha térfogatváltozás nincs ha különböző fixálókkal is u.a. az eredmény

7 Fixáló: + stabilizálja az „élő” struktúrát - attól (jelentősen) eltérő struktúrát eredményez rossz fixálás: fiziológiás elváltozás strukturális elváltozás apróbb (strukturális, térfogati) változás jó fixálás: nincs látható elváltozás 4.1 Fixáló oldat: a. fixáló ágens b. hordozó közeg Fixálási környezet: pH ozmolaritás ion koncentráció és összetétel

8 4.1.1. Fixálók: teroxidok /OsO4, RuO4, ruthenium
hexammine trichloride/ aldehidek /GA, FA, akrolein, stb./ KMnO4 /és más permanganátok/ uranil acetát 4.1.2 „Hordozó” közeg: követelmények: állandó pH fixálás során ozmolaritás ionösszetétel ne legyen toxikus, büdös pufferek + ozmotikumok + ionok foszfát puffer /Sörensen f./ jó kakodilát puffer As (toxikus) veronál acetát puffer barbiturál (toxikus) és büdös kollidin büdös (piridin) szerves pufferek jók, de drágábbak

9 pH: 6.8 – 7.5 (8) OsO4 – pH: 6.0 uranil acetát – pH: 5.0 Ozmolaritás: minta saját ozmolaritása (optimális) fixáló penetrációja membrán permeábilitás változás fixáláskor fixáló ozmotikumként viselkedik-e kissé hipertóniás jobb, mint hipotóniás beállítás: puffer koncentráció (itt nem a fixálóé!) fixáló koncentráció ozmotikum (NaCl, glukóz, szacharóz, mannitol) gl., szach. OsO4-nál nem, aldehideknél jó Ionösszetétel: monovalens jó (NaCl) bivalens membránokra jó, De: precipitáció, fiziológiás elváltozás (Ca, Mg, bikarbonát) lehet!

10 Amőba sejt részlete A: konvencionális, enyhén hiperozmotikus környezet B: freeze-substitution Apró különbségek: plazmamembrán és vakuolumok membránjainak „kifeszült” megjelenése

11 4.2 Pufferek: 4.2.1 Foszfát puffer: fiziológiás bivalens ionok nem toxikus pH nem változik a hőmérséklettel, stabil - precipitáció lehet mikroorganizmusok szeretik lassú penetrációjú és reaktív fixálókhoz is Sörensen féle mono- és dibázikus Na-foszfát Na-K-foszfát  4.2.2 Kakodilát puffer: + stabil nincs csapadék - rossz szagú toxikus aldehidekkel (első fix.) foszfát pufferhez hasonló eredmény

12 4.2.3 Veronál acetát puffer:
+ nincs csapadék /2. és 3. fix./ - csak néhány szövetre jó (OsO4-el) nem tárolható (mikroorganizmusok) aldehidekkel reagál (puffer kapac.) 4.2.4 Kollidin: -(s)-kollidin (2.4.6-trimetil piridin) Nem ajánlható, csak speciális esetben!! + pH:7.4-nél igen jó puffer kapacitás szobahőn is stabil jól penetrál – nagy blokkok fixálása - extrakció - OsO4 /nagy blokk és 2. fix. -jobb/ membránsérülések toxikus és büdös

13 4.2.5 PIPES puffer: piperazin-N,N’-bis(2-ethanesulfonic acid) 0.3 M ozmolaritást ellenőrizni /2x-3x hígítani/ pH között 0.1 M NaOH  4.2.6 HEPES puffer: N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid 0.2 M pH között -0.2 M NaOH 4.2.7 MOPS puffer: 3-(N-morpholino)propane-sulfonic acid   0.2 M pH között-0.2 M NaOH

14 A FA+foszfát puffer – jó struktura
Neutrofil granulocita A FA+foszfát puffer – jó struktura B FA+kakodilát puffer – jó struktura C FA+kollidin – erős kimosódás, membránsérülések

15 4.3 Fixálók: 4.3.1 Tetroxidok OsO4 : 1927 Strangeway and Canti – FM fixálók sötétlátóteres mikroszkópia - „jobb felbontás” EM – első ultravékony metszetek lassú penetrálás – kicsi minta /0.5-1 mm átmérő/ /puffer meggyorsíthatja – ion és membrán kölcsönhatás/ főként lipideket (foszfolipid) fixál /ezeket aldehidek nem!/ festés is egyben membrán permeábilis lesz – minta ozmolaritása változik /puffer kevésbé fontos 2. fix.-nál/

16   Os4 fixálásra elváltozás: mielin – zsugorodás izolált sejtek – enyhe duzzadás (NaCl) Ca – jó /1-3 mM , ha több: precipitáció) Mg – jobb?? csersav hozzáadása: jobb fixálás, jobb nehézfém ion kötés Forgalmazás: kristályos ill. oldott - ampulla Tárolás Előkészítés: törzsoldat oldás – 24 óra!!! szonikálás – rövidebb idő használat: elszívófülke!!! /erősen párolog/ hulladék kezelése műanyagon át is penetrál

17 használat: elszívófülke!!! /erősen párolog, nyálkahártya irritáló/ erős oxidálószer – mindent feketére színez hulladék kezelése műanyagon át is penetrál alkalmazhatóság: foszfát puffer + OsO – jó (de csersavval nem) kakodilát puffer + OsO4 – inkább 2. fix., (csersavval is) veronál a. puffer + OsO4 – nem ajánlott (2. fixálás) kollidin + OsO – nem ajánlott (2. fixálás) ma: GA után, mint 2. fixáló

18 4.3.1.2    Ruténium tetroxid (RuO4)
fixálás-festés 1887-től napjainkban részben hisztokémia, részben fixáló fixáláskor történő alkalmazása ritka + poliszacharidokkal is reagál finomszemcsés festődés – jobb feloldás - nehezen penetrál, külső sejteket fixálja csak gomba sejtfalon (intakt) is nehezen jut át protoplasztok, izolált sejtek, kis minták (1 mm3 ) jó szobahőmérsékleten fixálás (4 oC nem ajánlott) erőteljes oxidálószer, bomlékony (friss: aranysárga) egészségre káros - elszívófülke

19 forgalmazás: kristályos
0.5 % oldat – ampullában fixálás (egyben festés): % RuO4 oldat

20 4.3.1.2  RHT – Ruthenium hexammine trichloride
Mw: 309.6   inkább festék, de OsO4 után alkalmazzák nagy töltéssűrűség (3+), kis molekulasúly, nincs aggregáció OsO4 után RHT (kakodilát puffer) – nem kell utólagos festés finomszemcsés festődés – jobb feloldás GA-val stabilizáló – proteoglikánok, szénhidrátok, (kakodilát p.) extracelluláris mátrix + 2.5 % GA + 1% OsO % RHT pH: 7.4 fixálás: szoba hőmérsékleten (4 oC nem ajánlott) oldatot használat előtt 1 órával csinálni!!! /bomlás/ foszfát puffer és kollidin nem optimális hozzá forgalmazás: aranysárga por, stabil forma éveken át

21 glutáraldehid C – CH2 – CH2 – CH2 – C
O 4.3.2 Aldehidek: – C H O O glutáraldehid C – CH2 – CH2 – CH2 – C H H formaldehid H – C O O paraformaldehid C – O– CH2 (– O CH2 )n– O – C H H CH2 akrolein CH C (glioxál, krotonaldehid, acetaldehid, metakrolein)  foszfát és kakodilát pufferben jó fixálók (esetleg kollidin)

22 4.3.2.1 Glutáraldehid (GA): önállóan nem jó igazán
/OsO4 sem!/ napjainkban: GA + OsO4 illetve (FA+GA) + OsO4 + dialdehid – keresztkötés – tárolható minta fehérjékkel reagál – OsO4 mellett fehérje extrakció kisebb /glikogénnel reagál – OsO4 erősebben festi/ lipidekkel nem reagál /akár 95% veszteség, OsO4 ezt csökkenti/ nem változtatja meg az ozmotikus viszonyokat a mintában belépéskor, így a puffer ozmolaritása meghatározó Tehát GA jó fixáló, de OsO4 utófixálás elengedhetetlen

23 GA minősége: monomer – polimer aránytól függ
/280 nm/ /235/ nm tisztítás: desztillálás oC (olaj 154 oC) aktívszenes mosás – szűrés tárolás: hőmérséklet igen fontos (+4, vagy -20 oC) forgalmazás: ampullázott (25, 50%) „nyers” oldat (elvileg 25%) pH: 6.8 – (7.5 felett GA polimerizálódik) használat: 2 - 4% első fixálóként (0.05% előfixálásnál) Ca használata nem zavaró pufferek: foszfát puffer – jó kakodilát puffer – jó veronál acetát puffer – nem használható kollidin – nem ajánlott szerves pufferek – jók

24 Formaldehid (FA): eleinte rossz volt (11-16% metanol!) paraformaldehidből frissen – jó fixáló + jól penetrál (nagyobb blokkok, precipitáció kisebb) foszfát puffer kissé lemarad fehérjékkel reagál – de monoaldehid! lipidekkel is reagál (korlátozottan) - fixálás után a minta pufferben nem tartható el hosszan lipidekre utófixálás kell FA nem ozmotikum – puffer ozmolaritása meghatározó  (membrán szemipermeabilitás részben megmarad) FA jó fixáló, jól penetrál, de OsO4 utófixálás kell, Ca jó

25 FA felhasználás: foszfát puffer – jó, ha lehet, ezt használni – 4% FA kakodilát puffer – jó, Ca kell, hűtőben stabil – 4% FA veronál acetát puffer – kerülni kollidin – 10% FA nagy blokk, jobb behatolás, de extraktív, ezért csak indokolt esetben GA + FA keverék jobb hatásfokú első fixáláshoz FA gyors penetráció, reaktívabb GA keresztkötések, stabilizál 4% FA + 2% GA % CaCl2 0.07–0.1 M kakodilát /foszfát/ puffer

26 4.3.2.3 Akrolein: nagy/tömött/növényi minták
+ leggyorsabban penetráló aldehid fixáló /0.5-1%/ - toxikus lipidoldó hatás enzimaktivitást gátló mikrotubulusok szétesnek Akrolein+GA – FA+GA alternatív /OsO4 utófixálás kell/ 1% akrolein + 2-4% GA (0.1 M foszfát puffer, pH 7.2) ozmolaritás, CaCl2 vagy MgCl2 1-3 mM Akrolein+GA+FA igen tömör, növényi anyagokhoz

27 4.3.3 Permanganátok: KMnO4 /Na-, Zn-, Ba-, La-permanganát/ régebben gyakori volt , ma botanikai, mikológiai, membránvizsgálatoknál kivételesen - extraktív hatás (GA+ OsO4 fixálás hasonlítás) fehérje, lipid (membránt is károsítja) RNA (DNA megőrződik, bár rosszul) duzzadás, morfológiai deformáció – 0.5% NaCl 0.5-1% KMnO4 /K2Cr2O7+ OsO4 jobb, de nem jelentősen/

28 4.3.4 Keverék fixálók: pl. GA + OsO4 együtt
más hatás, mint egymás után – reagálnak más állapotúak (?) kompetició az aminosavakért (?) frissen készíteni 2.5% GA+1% OsO4 0.1M kakodilát pufferben (pH:7.2), utófixálás uranil acetátban 0 oC max. 1 óra 4.3.5 Speciális fixálók: inkább csak adalékként szerepelnek uranil acetát: membrán stabilizáló (?) enyhe extrakció /pl.glikogénre/ 0.25-2% víz, veronál acetát puffer pH:5.0 !! /foszfát és kakodilát nem, kiválások!/ ferricianid, digitonin, trinitro-komponensek (pikrinsav származékok)

29 4.4 Fixálás módja: általános recept nincs!
irodalmi receptek hasonlót adaptálni - módosítani általános szempontok: gyorsan (degradáció megelőzése) immerziós in situ perfúziós kicsi minta (penetráció), ha nagy minta – nagy penetrációjú fixáló és puffer (FA, akrolein, kollidin) keverés kicsi edények (anyag, pénz) idő /mintafüggő/ - hosszú: műtermék képződés hőmérséklet /pl. mikrotubulusok alacsony hőn rosszul/ mikrohullámú sugárzás diffúzió /hő!/ rotáció reakció ráta

30 mosás: aldehid – OsO4 között fontos
0.5-2 óra /éjszaka/ - tárolás mosás a „hordozóval” /bár ozmolaritás itt már nem olyan fontos/ növényi minták: vízvesztést kerülni, kicsi minta, kettős fixálás, vákuum – szőrök közötti, intercelluláris térben levegő gombák: mint növények, celofán módszer monolayer kultúrák: petri csészében,tárgy-, vagy fedőlemezen (teflon spray) izolált sejtek, sejtorganellumok: centrifugálás, szűrés, agar,alginát, fehérje baktériumok: agar, alginát, fehérje tengeri élőlények: GA és OsO4 tengervízben oldva

31 5. Dehidratáció: (min. minta V 10x) etanol
aceton hasonló hatás, de aceton erősebben higroszkópos, így dehidrálás tökéletlen lehet (abs. aceton lépésnél) gyanta minősége döntő: vízoldékony – nem kell polieszter – aceton etanol, végén aceton etanol, végén sztirén epoxi – aceton etanol, végén propilénoxid

32 5.1 Kémiai hatás dehidratálás: minta – oldószer
5.1.1 Lipid kioldás: akár 95% (főleg 70% felett, ill. PO) mértéke redukálható OsO4 fixálás uranil acetát fixálás aceton használata alacsony hőmérséklet gyors munka 5.1.2 Fehérje kioldás: kb. 4% (főleg (70% alatt, 95% - PO nincs) mértéke redukálható GA fixálás 5.1.3 Lipid és fehérje kioldás miatt zsugorodás – minimalizálni dehidratáció gyenge hatású artefakt képző, fixálókhoz hasonló nem kritikus lépése a munkának Lehet 0 oC-on, 4 oC-on, szobahőn – nincs igazán nagy jelentősége

33 5.2 Általános menete: (15), 25, 50, 70, 90, 96(95), 100% etanol, v. aceton intermedier folyadék (pl. etanol után PO) – párolgás, tűzveszélyes 10-15 perc az egyes lépésekre (kompakt anyag, növényi minta, nagy blokk 20 perc) idő csökkenthető: minták mozgatása, közeg keverése szobahőmérsékleten 4 vagy 0 oC helyett oldatok cseréje kisebb blokkok (infiltráció is gyorsabb!)   tárolás – éjszakára 70% etanolban (hűtőszekrényben) szupergyors víztelenítés: a fentieket maximálisan kihasználva így kb. 2 percre is csökkenhet a dehidratáció + 1 perc absz. etanol + 2 perc PO (3x csere!)

34 5.3 Részleges dehidratálás:
pl. EPON 812 oldható 70% etanolban menete: 30% (15’), 70% (30’), 70% (30’) 1:1 70% etanol és EPON 812 keverék (30’) beágyazó EPON 812 szobahőmérsékleten (60’) beágyazó EPON oC (30’) polimerizáció

35 5.4 Etilén glikol: fixálás nélküli víztelenítés
nem okoz jelentős konformáció változást (immunológiai, citokémiai alkalmazás) PEG 200 is használható menete: 5 ml 10% etilén glikol 50% fölé növelni 5 perc alatt (cseppenként 7 ml etilén glikol hozzáadás, rázatás, szövet átlátszó lesz) további víztelenítés (2-3 perc tiszta e.g.-ban) a minta 4 oC-on eltartható tiszta etilén glikolban, abból közvetlenül átvihető: hidroxipropil metakrilátba epoxi gyantába poliészter gyantába nem! lipid vesztés van! (70% e.g.-ban GA és OsO4 véd) zsugorodás és destrukció van

36 5.5 Intermedier folyadék: etanol, propilén oxid
szerepe: intermedier dehidratáló infiltráció közege I.             infiltráció: cc. PO + gyanta (1:1) (fokozatosabb átmenet 2:1, 1:1, 2:1) II.               infiltráció dehidratálás közben: 20 és 40% PO vízben 70% vizes PO + EPON 812 (1:1) 90% vizes PO + EPON 812 (1:1) 100% PO + EPON 812 (1:1) tiszta EPON 812