Biotechnológia, génmanipulációk, transzgenikus élőlények

Az előadások a következő témára: "Biotechnológia, génmanipulációk, transzgenikus élőlények"— Előadás másolata:

1 Biotechnológia, génmanipulációk, transzgenikus élőlények
Kulcsszavak: Southern blot, hibridizálás, restrikciós endonukleáz, PCR, szekvenálás Dékány Bulcsú Humánmorfológiai és Fejlődésbiológiai Intézet

2 Biotechnológia Rekombináns DNS technológia DNS klónozás
Restrikciós endonukleáz Gélelektroforézis Hibridizáció Southern blot Rekombináns DNS DNS ligáz Baktérium transzfromáció Plazmid, vektorok, klónozó vektorok DNS könyvtár- genomika cDNS könyvtár-mRNS PCR DNS szekvenálás, humán genom projekt In situ hibridizáció

3 Klónozás A DNS-klónozás során egy DNS-fragmentumot megfelelő gazdasejtben sokszorosítanak, amplifikálnak. klón: Genetikailag azonos sejtek vagy egyedek összessége, amelyek aszexuális osztódással keletkeznek egy közös őstől. Aszexuális úton létrejött egyed, amely azonos "szülőjével". (A "klónozás" alapjelentése valamit végtelen számban előállítani.) Dolly Tapsilla, Klonilla (magyar vonatkozás) Dolly: birka emlőszövet sejtmagját bejuttatták egy enukleált petesejtbe, majd az ebből fejlődött embriót álvemhes anyába ültették. Dolly, július 5., Edinburgh

4 Klónozás áttekintű ábrája
Enukleálják a petesejtet Emlőszövet sejtmagját izolálják Az emlőszövet sejtmagját beültetik az enukleált petesejtbe Az ebből fejlődött embriót álvemhes anyába ültetik

5 Gyakorlati felhasználás
Apasági vizsgálat Bűnügyi minták feldolgozása igazságügyi orvostani vizsgálatok Mutációk keresése Örökletes betegségek diagnosztizálása diagnosztikai vizsgálatok A különböző vizsgálati anyagokból a DNS felsokszorozása PCR-ral történik, tipizálásuk pedig gélelektroforézissel. Lépései: Mintavétel (haj, szájnyálkahártya törlet, vér) DNS felsokszorozása PCR-ral Tipizálás elektroforézissel/génszekvenálás DNS minták kiértékelése Szakvélemény

6 Biotechnológia Interdiszciplináris tudományterület.
Klasszikus biotechnológia: olyan gyártási eljárást jelent, melyben valamilyen élő szervezet vagy annak alkotórészei végzik a termék előállítását. Pl. sör, bor, tejkészítmények. Az új biotechnológiai eljárásokban az ember által bizonyos célból genetikailag módosított élő szervezetek vesznek részt: - mikroorganizmusok - állatok - növények Területekre osztható: piros: diagnosztikai módszerek fehér: ipari biotechnológia zöld: agrár biotechnológia szürke: környezettechnika, környezetvédelem

7 Biotechnológia Az új biotechnológiai megközelítés lényege, hogy a kívánt fenotípust új/mutáns/szintetikus/szensze/antiszensze gének bevitelén keresztül új vagy módosított fehérjékkel, az anyagcsere megváltozásával érjük el. A génműködés vizsgálatának lehetőségei: Gén (vagy termékeinek) bejuttatása megfelelő gazdasejtbe vagy gazdaszervezetbe és az előidézett fenotípus változások tanulmányozása A sejt vagy szervezet saját, endogén génjének vagy a gén termékeinek megsemmisítése vagy hatástalanítása és a gén normális funkciójának megállapítása az észlelt működéskiesések alapján

8 Rekombináns DNS technológia
DNS szakasz azonosítása, izolálása, jellemzése Beépítés hordozóba (vektor + DNS fragment) Bejuttatás gazdasejtbe Elszaporítás gazdasejtben Tisztítás és vizsgálat Példa: humán gyógyszerkészítmény, amit rekombináns technológiával készítenek, az inzulin. -> Ez az első génsebészeti termék Humulin: rekombináns baktériumokkal előállított humán inzulin. Tehát baktériumokban működő emberi gén termelte. Tudománytörténet: 1971 Paul Berg állította elő az első rekombináns DNS-t. Egy rákkeltő majomvírus DNS-ét kapcsolta össze E. coli egyik bakteriofágjának DNS-ével.

9 Restrikciós endonukleáz
Restrikciós-modifikációs rendszerek: fágszaporodás korlátozását okozó jelenség baktériumokban: a restrikciós rendszerek darabolják az idegen DNS-t specifikus endonukleáz enzimaktivitással. A restrikciós endonukleázok a kettős szálú DNS molekula meghatározott bázissorrendű szakaszait ismerik fel, ha az nincs a megfelelő módon metilálva, akkor hasítják. Több típust különböztetünk meg aszerint, hogy a felismerés és hasítás hol és hogyan történik. A II. típusú restrikciós enzimek leggyakrabban 4-es vagy 6-os ún. palindrom szerkezetű (pontszimmetrikus) felismerőhellyel rendelkeznek. A keletkezett DNS fragmenteknek a hasítás következtében tompa végük, vagy ragadós végük lesz. Ragadós vég-aszimmetrikus hasítás esetén Tompa vég-szimetrikus hasítás esetén Palindrom szekvencia (szójátok géza kék az ég)

10 DNS ligáz Bármilyen eredetű két vagy több DNS-fragment összekapcsolódhat, ha kompatibilis véggel (a szálvégek komplementerek egymással) rendelkezik. Ezáltal a DNS-fragment beépíthető egy vektorba, majd a gazdasejtbe juttatható, ahol róla transzkripció történhet. A beépítéshez azonban egy további enzimre van szükség. Ez a ligáz. A két szomszédos fragment között a DNS cukor foszfát gerinc folytonosságát, a nukleotidok közötti foszfodiészter kötést ligáz enzimek állítják helyre. A DNS-fragment vektorba építésekor is fontos szerepet játszik a fragment és vektor komplementer végeinek összeligálása formájában. U-A, C-G

11 Rekombináns DNS Ligáz enzim segítségével két különböző, de megfelelő komplementer végekkel rendelkező DNS-fragment is összeilleszthető → ennek eredményeként rekombináns DNS keletkezik. Ligáz enzim segítségével

12 Transzformáció A restrikciós enzimekkel létrehozott, és agaróz-gélen elválasztott DNS-fragmenteket vissza kell juttatni valamilyen sejtbe, hogy azzal együtt el tudjuk szaporítani. Önmagában egy DNS-fragment nem képes replikálódni a sejten belül, ezért olyan hordozó, vektor DNS molekulával kell összekapcsolni, ami képes egy adott rendszerben replikálódni. Ezek a klónozó vektorok lehetnek: plazmid eredetűek (horizontális géntranszfer) vírus eredetűek mesterséges kromoszómák is A plazmidoknak nevezzük a baktériumokban, az archeákban, valamint egyes élesztőgombákban, algákban ésnövényfajokban található, az örökítő információk sejtek közötti átadását a kromoszómáktól függetlenül is lehetővé tevő determinánsokat. A plazmidok általában gyűrű alakú és kettős szálú DNS-molekulák. (

13 Vektorok biztosítja a klónozandó DNS védelmét, bejutását és osztódását a gazdasejtbe különböző céloknak megfelelően tervezett, mesterségesen kialakított DNS molekulák, melyek gyakran természetes, élő rendszerekkel vannak kombinálva a klónozandó DNS-sel való összekapcsolásuk eredménye a rekombináns plazmid fontos a vektor és a rekombináns vektor sejtben való jelenlétének kimutathatósága Multicloning site a plazmid egyedi restrikciós hasítóhelyeit tartalmazza.

14 Vektorok Klónozó Plazmid Lambda fág!!! BAC YAC Expressziós Jellemzői:
Prokarióta Eukarióta Élesztő Bacillo vírus Emlős sejt Jellemzői: replikációs origo a replikációt elindító DNS szekvencia szelektálható marker, olyan gén, aminek a jelenlétére lehet szelektálni, így a vektort tartalmazó sejtek szelektíven felnöveszthetők, kizárva a vektort nem tartalmazó sejteket (pl.: antibiotikum rezisztencia) klónozó hely, vagyis egy vagy több olyan restrikciós endonukleáz hasítóhely, amelyből a vektoron csak egy található, hogy az idegen, inszert DNS beépítését segítse Expressziós vektor: tartalmazza mindazokat a szignálokat, amelyek az inszert átírásához (pl. promoter) szükségesek. Inszert: Idegen DNS darab.

15 Plazmidok Baktériumokban előforduló, nem esszenciális, extrakromoszomális, önállóan replikálódni képes, cirkuláris DNS molekula, amely a jobb alkalmazkodást segíti. Ideális vektor tulajdonságai: ideális szelektálható marker - antibiotikum rezisztencia kis méret - könnyebb izolálni, transzformálni nagy kópiaszám - kevés sejtből sok DNS tisztítható Klónozó hely, vagy poliklónozó hely, egyedi restrikciós hasító helyeket tartalmazó, megtervezett, szintetikus DNS-szakasz, sokféle enzimmel létrehozott DNS-inszert építhet könnyen bele inszert „jelzés”: az inszert beépülés detektálható Miért jó „észrevenni” az inszert beépülését ? Mert ritka esemény! A vektor és az inszert DNS összekapcsolódása, megfelelő kompatibilis ragadós végek esetében is, véletlenszerű (kettős „találkozás”) Gyakorisága 1-10% között van, ideális reakciókörülmények esetében is. Sok transzformáns között kell megtalálni tehát az „igazit”. Ezért úgy alakítják ki a vektorokat, hogy az inszert beépülése egy gén inaktivációjához (elrontásához) vezessen.

16 Genomkönyvtárak a sejt teljes génállománya a megfelelő méretű fragmentekre darabolva vektor molekulákba (pl. lambda fág) építhető a rekombináns DNS molekulákat fágfehérjékkel becsomagolják és fertőzéssel bejuttatják Escherichia coli baktérium sejtekbe ha a genomtárból egy meghatározott szekvenciával rendelkező DNS-darabot akarnak kiválasztani, a bakterológiai lemezen létrejött tarfoltok DNS-ét egy filterre viszik át, majd molekuláris hibridizációval választják ki Az Escherichia coli (kólibaktérium vagy kólibacilus) egy rövid, Gram-negatív baktérium az Enterobacteriaceaecsaládban, az Escherichia nemzetség legismertebb faja. Általában peritrich csillós, de lehet csillótlan is.[1] Tokja általában nincs, de lehet tokos. Aerob, fakultatív anaerob. Könnyen és jól tenyészthető. Rendszerint meleg vérű állatok tápcsatornájának alsó szakaszában él. A legtöbb szerotípus ártalmatlan, de vannak olyanok is, mint például azO157:H7, mely emberben ételmérgezést okozhat.[2][3] A veszélytelen törzsek az emésztőrendszer normális flórájához tartoznak, K2-vitamint termelnek.[4] Jelenlétük megnehezíti egyes patogének elszaporodását a bélrendszerben.[5][6]1885-ben fedezte fel Theodor Escherich német gyerekorvos és mikrobiológus.[7] Az E. coli és hasonló baktériumok képesek DNS-részletek átadására bakteriális konjugáció útján.

17 cDNS géntár magasabb rendű eukarióták genomjában nem kódoló (intron) és kódoló (exon) szakaszokat különböztethetünk meg transzkripció során ezek az intron szakaszok különböző mechanizmusoknak köszönhetően kivágódnak → az érett mRNS-ben már nincsenek jelen problémát okoznak a génátviteli kísérletekben: sokszor nagyméretűek célsejt nem feltétlenül eukarióta (prokariótákban nincs intron → nem rendelkezik az azt kivágó apparátussal sem) bejuttatott gén a fehérjeszintézisét nem tudja irányítani probléma megoldása → cDNS géntár lényege: a vizsgált gén által kódolt (érett) mRNS-t DNS (cDNS, complementer DNS) formájába írják át, és ezt a cDNS-t klónozzák reverz transzkriptáz enzim (centrális dogma!) célja általában az, hogy gyakorlati felhasználásra különböző fehérjéket termeltessenek (pl. inzulin, interferon, növekedési faktor……) Intronok kivágódása: spilicing A köv. lépés a fehérje lenne, de ->problémák

18 Centrális dogma és barátai
Transzkripció Reverz transzkriptáz Transzláció

19 A klónozott gén vizsgálata gélelektroforézis Southern blot Western blot Northern blot PCR

20 Gélelektroforézis módszer lényege: vizes közegben létrehozott elektromos térben a töltéssel rendelkező molekulák elmozdulnak az ellentétes töltésű elektród felé vándorlásuk iránya vagy sebessége különböző, egymástól tehát fizikailag elválaszthatók legfontosabb módszerek: poliakrilamid gélelektroforézis, agaróz gélelektroforézis Agaróz gélelektroforézis: az agaróz egy poliszacharid, vizes szuszpenziója hevítés majd lehűtést követően géllé dermed agarózláncok hidrogénhidakkal térhálót hoznak létre nukleinsav frakcionálásra (DNS fragmentek) használják, a futtatás vízszintes géllemezben történik az elválasztás méret szerint történik futtatást követően etídium-bromiddal vagy más fluorescens festékkel teszik láthatóvá a nukleinsavakat A DNS semleges kémhatás környékén negatív töltésű, tehát elektromos erőtérben majd a pozitív töltés felé fog haladni. A DNS molekula vándorlási sebessége fordítottan arányos a molekula tömegének logaritmusával. A DNS láthatóvá tételéhez etídium-bromidot fecskendeznek a gélbe, amely egy interkaláló festék, amely a DNS-hez kötődik. UV-fénnyel megvilágítva 590nm hullámhosszúságú fényt bocsájt ki.

21

22 Hibridizációs technikák - Southern blot
ha denaturált nukleinsavat valamilyen módon jelölt nukleinsavpróba jelenlétében renaturálnak, a jelölt próba bázispárosodni képes a vizsgált mintában jelenlévő, esetleg komplementer láncokkal → detektálható hibrid képződik vizsgálható, hogy két nukleinsavlánc (minta és próba) komplementer-e ha igen, milyen mértékben számos molekuláris biológiai technika alapját képezi, pl. Southern blot, in situ hibridizáció, FISH, RFLP

23 Southern blot célja, hogy nagy molekulasúlyú DNS-ből azonosítson olyan restrikciós fragmentumokat, amelyek valamilyen szempontból érdekes DNS-régiót tartalmaznak restrikciós endonukleázzal vágott agaróz gélen elválasztott fragmenteket, lúgos közegben denaturációt végeznek és a DNS-t a gélből nitrocellulóz vagy nylon membránra viszik át radioaktív próbával a hibridizációt a membránon végzik el → a keresett fragmentum az audiogrammon csíkok formájában fog megjelenni

24 Southern blot

25

26 Polymerase chain reaction
a polimeráz láncreakció egy bizonyos DNS szakasz felamplifikálására (megsokszorozására) képes egy DNS mixben működéséhez szükséges: szintetizálandó új szál szekvenciáját meghatározó, templát DNS szál a szintézis kezdetét meghatározó primer: azok az oligonukleotidok, amelynek segítségével meghatározzuk a szintézis kezdetének helyét és irányát dezoxiribonukleotid-trifoszfát ( dATP, dCTP, dGTP,dTTP) a polimeráz láncreakciónál két oligonukleotid primer által behatárolt DNS szakaszt sokszorozunk meg egy hőstabil DNS polimeráz és számos egymást követő szintézis ciklus segítségével Lépései: szálak szétválasztása (denaturálás) a primerek kötődése (annealing) az új szálak bioszintézise (extension) Primer: előre elkészített és lehet véletlenszerű, ha nincs információnk az adott génről. Primer: DNS vagy RNS, mely kijelöli az újonnan szintetizálódó szál kezdőpontját.

27 Polymerase chain reaction
Denaturálás azt a hőmérsékletet, melynél egy adott kettős szálú DNS fele denaturálódott, egyes szálú állapotban van → olvadási hőmérséklet, jele Tm (melting temperature, ált C) ez az a hőmérséklet, melynél a potenciális primerkötő helyek felén primer található ezen a hőmérsékleten az enzimatikus reakciók leállnak → hőstabil polimerázra van szükség (pl. Taq polimeráz) Annealing hőmérséklet csökkentése, oligonukleotid primer képes bekötődni a DNS szál komplementer helyére (ált C) kritikus fázis, reakció specifitása attól függ, hogy a primerek csak a megfelelő célszekvenciához kössenek Extenzió polimeráz optimális hőmérsékletének biztosításakor megszintetizálódik a komplementer DNS szál (ált. 72 C) Taq polimeráz: A Thermus aquaticusból (mely egy melegvízű forrásokban élő baktérium faj) nyert „hőstabil” DNS polimeráz.

28 Polymerase chain reaction

29 Polymerase chain reaction
Néhány óra alatt milliárdnyi másolat!

30 In situ hibridizáció Ezekkel a módszerekkel sejtek és szövetek (köztük tumorok) kromoszomális szintű vizsgálata valósítható meg, anélkül, hogy a sejteket mesterséges körülmények között tenyésztenénk, és így az eredeti genetikai eltéréseket esetleg megváltoztatnánk. Alkalmazásának a citogenetikában van jelentősége. Metafázikus kromoszómához jelölt (fluorescens) próbát hibridizáltatunk, majd detektáljuk. Kariotipizálás. Lásd a sejtciklusról szóló előadásban! -> Metafázis: Kromoszómák egyenlítői (aequatorialis) síkban rendeződnek: aequatorialis lemez. Ingázások után a kromoszómák beállnak az egyenlítői síkba. Mindegyik kromoszóma egyik kromatidja az egyik, a másik kromatidja a másik pólushoz kötődik kinetochor MT-okkal. Ez az elrendezés biztosítja a pontos, szimmetrikus szegregációt. Kariotípus: Az egyed kromoszómáinak összessége, iIl. az egyed kromoszómáinak száma, alak és nagyság szerinti meghatározottsága.

31 DNS szekvenálás DNS-fragmentek elsődleges szerkezetének meghatározása
két módszer: Sanger-féle didezoxi, láncterminációs módszer Maxam-Gilbert módszer

32 DNS szekvenálás Maxam-Gilbert módszer:
először restrikciós hasításnak vetik alá a DNS molekulákat a keletkező kisebb fragmentumokat egyik végükön megjelölik 32P-t tartalmazó foszfátcsoporttal négy különböző reakciósornak vetik alá a jelölt fragmentumokat: mindegyik reakciósorban egy meghatározott bázisnál vagy bázisoknál hasítják el a DNS-t az így nyert még kisebb fragmentumokat elektroforézissel elválasztják, majd lánchosszuk szerint autoradiográfiával azonosítják a gélben levő négy reakciósor mindegyike esetében a bázis és nukleotid sorrendet a sávok helyzetéből következtetik ki

33 DNS szekvenálás Sanger-féle didezoxi, láncterminációs módszer:
első lépése az egyszálú DNS létrehozása felsokszorosítják a vizsgálandó DNS-t úgy, hogy közben didezoxi-nukleotidokkal megszakítják a replikációt a didezoxinukleotidok pentóz 3′-C atomjáról hiányzik az oxigén, ezért hozzá már nem kötődhet más nukleotid, mert hiányzik a 3′-as helyzetben levő hidroxilcsoport, és így nincs ami részt vegyen a foszfodiészter-kötés kialakításában → ahol beépül a láncba, ott megszakad a DNS-szál növekedése a szintézis négy kémcsőben zajlik: mindegyikhez különböző didezoxi-nukleotidokat adnak → az elsőbe ddATP-t (didezoxiriboadenint), így a lánctermináció az adeninoknál áll le → a másodikba ddCTP-t (didezoxiribocitozint), amely a citozinoknál állítja le a DNS szintézist → a harmadikba ddTTP-t (didezoxiribotimint), timinnél áll le → a negyedikbe ddGTP-t (didezoxiriboguanint), guaninnál áll le a DNS szintézis a reakció eredményeként mindegyik kémcsőben különböző hosszúságú fragmentumok sorozata képződik, amelyek közül egy adott kémcsőben mindegyik fragmentum ugyanarra a nukleotidra végződik mind a négy kémcső tartalmát agaróz gélelektroforézissel futtatják, az eredményt láthatóvá teszik pozíció alapján leolvasható a szekvencia, alulról felfelé 5’ → 3’ irányban A legrövidebb DNS-szakasz jut el a legmesszebb, így a leolvasást tőle kezdjük. Ez a gél alján helyezkedik el. Megnézzük, hogy a négy sáv közül melyikben található. Lejegyezzük ezt a sávot ezzel meghatározva a szekvencia első nukleotidját. Ezután megnézzük hogy a második legkisebb fragmentum melyik sávban található. Lejegyezzük ezt a sávot is, és így meghatároztuk a második nukleotidot. Hasonló képpen járunk el minden sáv esetén, míg végül megkapjuk a teljes szekvenciát.

34 Humán Genom Program A képen: Craig Venter Bill Clinton Francis Collins
2001 február: Venter et al.: The sequence of the human genome Science 291, International Human Genom sequencing Consortium Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 409, 3 milliárd nukleotid Térképpontok Craig: felülről lefelé Venter: alulról felfelé „golyószóró” (részben átfednek)

35 Érdekesség (nem megtanulni
Érdekesség (nem megtanulni!) Humán genomanalízis esetleges társadalmi hatásai A genetikai betegségek és rendellenességek felismerése sokkal gyorsabb és olcsóbb lesz. Egyénre szabott génterápia! A biztosító molekulárisan elemzi a biztosított genomját és abból következtet a várható élettartamra és betegségekre. Inteligencia és egyéb képességek felmérése a génjeink alapján. (Mi leszel fiam? Nem tudom, majd megnézem a génjeimet.) Genetikai predesztináció (arisztokrácia =>genokrácia) ? A kialakuló humán génsebészet lehetőséget ad az ember genetikai módosítására és természetesen a genetikai betegségek gyógyítására.

36 Köszönöm a figyelmet!

37 Az előadás alapjául szolgáltak:
Szabó Klaudia: azonos című előadása Heszky László & Galli Zsolt: „A genetika alapjai” Jancsik Veronika: „A sejt molekuláris biológiája”