A GFP in vitro génexpressziója

Az előadások a következő témára: "A GFP in vitro génexpressziója"— Előadás másolata:

1 A GFP in vitro génexpressziója
Kísérleti lépések A GFP in vitro génexpressziója és Fehérje analízis SDS-PAGE által

2 A kísérlet célja A zölden fluoreszkáló fehérje kifejezésre kerül egy E. coli sejtmentes rendszerben. 2. A kifejeződő GFP-t SDS-PAGE fogja kimutatni, majd molekuláris tömege is meghatározásra kerül.

3 A kísérlet időtartama 60 perc: A minta előkészítése, és az in vitro
génexpresszió összeállítása 120 perc: GFP kifejeződés 70 perc: Az SDS-PAGE végrehajtása 30 perc: A gél kiértékelése és a GFP molekuláris tömegének meghatározása

4 A kísérlet előkészítése
Melegítse fel a vizes fürdőt 30°C-ra. 30°C

5 A kísérlet előkészítése
3. DNase- / RNase-mentes víz előkészítése Készítsen elő csavaros kémcsőben 400 µl steril H2O-t, majd melegítse mikrohullámú sütőben 600 Watton 7 percig.

6 A kísérlet előkészítése
Az elektroforézis puffer előkészítése Hígítsa fel a koncentrált Tris/Glycin/SDS- buffert (TGS) 1:10 arányban desztillált H2O-val. Számoljon minden kamrára végső térfogatként 350 ml-t: 35 ml koncentrált TGS puffer ml H2Odeszt. (2 kamrára – egyenként 2-2 géllel – lesz szükség)

7 A kísérlet előkészítése
5. Csoportmunka: 8 csoport számára 8 törzsoldat előkészítése.

8 A kísérlet előkészítése
1. csoport: Az E.coli lizátum kiadagolása Címkézze fel a 8 piros kémcsövet a saját csoportszámával. Mérjen ki 12 µl-t az 1-es számú piros kémcső törzsoldatából (teljes térfogat: 120 µl) mind a nyolc felcímkézett kémcsőbe. Adjon minden csoportnak egy kémcsövet.  

9 A kísérlet előkészítése
2. csoport: A reakciókeverék kiadagolása Címkézze fel a nyolc zöld kémcsövet saját csoportszámával. Mérjen ki 12 µl-t a 2-es számú zöld kémcső törzsoldatából (teljes térfogat: 110 µl) mind a nyolc felcímkézett kémcsőbe. Adjon minden csoportnak egy kémcsövet.

10 A kísérlet előkészítése
3. csoport: Az aminosavas oldat kiadagolása 1.   Címkézze fel a nyolc kék kémcsövet a saját csoportszámával. Mérjen ki 14 µl-t a 3-as számú kék kémcső törzsoldatából (teljes térfogat: 130 µl) mindegyik felcímkézett kémcsőbe. 3. Adjon minden csoportnak egy kémcsövet.

11 A kísérlet előkészítése
4. csoport: A metionin oldat kiadagolása     1. Címkézze fel a nyolc sárga kémcsövet a saját csoportszámával. Mérjen ki 10 µl-t a 4-es számú sárga kémcső törzsoldatából (teljes térfogat: 105 µl) mind a 8 felcímkézett kémcsőbe. Adjon minden csoportnak egy kémcsövet.

12 A kísérlet előkészítése
5. csoport: A rekonstitúciós puffer kiadagolása 1.   Címkézze fel a nyolc rózsaszín kémcsövet a saját csoportszámával. Mérjen ki 7 µl-t az 5-ös számú kémcső pufferjéből (teljes térfogat: 70 µl) mind a 8 felcímkézett kémcsőbe. Adjon minden csoportnak egy kémcsövet.

13 A kísérlet előkészítése
6. csoport: A GFP vektor kiadagolása 1.  Címkézze fel a nyolc színtelen kémcsövet a saját csoportszámával. Mérjen ki 10 µl DNáz-mentes vizet mind a 8 felcímkézett kémcsőbe. Mérjen ki 1 µl GFP vektort a 6-os számú kémcsőből (teljes térfogat: 16 µl) mindegyik felcímkézett kémcsőbe, és rázogatással keverje el. Adjon minden csoportnak egy kémcsövet.

14 A kísérlet előkészítése
7. csoport: A Kaleidoszkóp standard kiadagolása 1.  Címkézzen fel 8 kémcsövet a saját csoportszámával. Mérjen ki 12 µl Kaleidoszkóp standard-ot a 7-es számú kémcsőből (teljes térfogat: 110 µl) mindegyik felcímkézett kémcsőbe. Adjon minden csoportnak egy kémcsövet. 

15 A kísérlet előkészítése
8. csoport: A „Lämmli puffer” kiadagolása 1.  Címkézzen fel 8 kémcsövet a saját csoportszámával. Mérjen ki 22 µl „Lämmli puffert” a 8-as számú kémcsőből (teljes térfogat: 200 µl) mind a 8 felcímkézett kémcsőbe. Adjon minden csoportnak egy kémcsövet.

16 Az adagok szétosztása Az következő kémcsövek minden csoport tartójában ott kell hogy legyenek.

17 Az in vitro expresszió összeállítása

18 1. Az in vitro expresszió összeállítása
1.1 Mérjen ki a vörös kémcsőbe 1, amely már tartalmaz 12 µl E.coli lizátumot 1. 10 µl reakciókeveréket (zöld kémcső 2) 2. 12 µl aminosavat (kék kémcső 3) 3. 1 µl metionint (sárga kémcső 4) 4. 5 µl puffert (rózsaszín kémcső 5) 5. 10 µl GFP vektort (színtelen kémcső 6)

19 1. Az in vitro expresszió összeállítása
Feladat: ellenőrizze UV fény alatt a vörös csőben a fluoreszkáló anyag jelenlétét.

20 1. Az in vitro expresszió összeállítása
1.2 Inkubálja a reakciókeveréket 120 percig 30°C-on a vízfürdőben. 30°C

21 Az in vitro expresszió kiértékelése
  120 perc inkubálást követően UV fény alatt vizsgálja meg, látható-e a GFP kifejeződés.    

22 Az SDS-PAGE végrehajtása

23 2. A gél lapka előkészítése
2.1 Vágja fel az előreöntött gél csomagolását a vonal mentén és vegye ki a gél kazettát.

24 2. A gél lapka előkészítése
2.2 Vágja fel borotvapengével vagy szikével a gél kazetta szalagját a megjelölt vonal mentén, és távolítsa el alsó szalagot.

25 3. Az elektroforézis kamra előkészítése
3.1 Rakja a gél kazettát a rövidebb végével befelé fordítva az elektród-kamrába. Rakjon egy másik gél kazettát vagy egy vak kazettát a kamra másik oldalára is. 3.2 Helyezze el az elektród állványt a szorító keret közé és zárja be a pántokat. 3.3 Rakja be a szorító keretet benne az elektród-kamrával a puffer tartályba. 3.4 Húzza ki a fésűt.

26 4. A kamra megtöltése 4.1 Töltse meg az elektród állványt 140 ml TGS pufferrel. 4.2 Töltse meg a puffer tartályt 200 ml TGS pufferrel.

27 Az elektroforézis kamra előkészítése
Útmutató: Ha a puffer kifut a szorító keretből akkor vegye ki a puffert, és rögzítse újra. Ha a puffer ismét kifut, töltse ugyanazt a mennyiséget a puffer tartályba, mint amit az elektród állványba.

28 5. Az SDS-PAGE előkészítése
5.1 Címkézzen meg egy új, színtelen kémcsövet a saját csoportja számával. 5.2 Két órával a génexpresszió után helyezzen át 20µl-t a vörös kémcsőből a címkézettbe. 5.3 Mérjen ki 20µl Lämmli puffert (8-as kémcső) a megcímkézett kémcsőbe és rázogatással keverje el.

29 6. A nyílások megtöltése Két csapat osztozik egy gélen
A jobb és a bal nyílás üresen marad

30 6. A nyílások megtöltése 6.1 Töltse meg a nyílásokat a következőkkel: - 10 µl Kaleidoszkóp fehérje standard (KP, 7-es kémcső) - 10 µl az 1. csoport mintájából (P1) - 10 µl a 2. csoport mintájából (P2) - 10 µl Kaleidoszkóp fehérje standard (KP,7-es cső) KL P P KL --

31 7. Az elektroforézis végrehajtása
7.1 Zárja be a gél kamrákat és kezdje meg a gélelektroforézist 200V-on 7.2 Állítsa le a folyamatot, amikor a Bróm-fenol kék eléri a gél alacsonyabb végét. ( ez kb. 25 percet vesz igénybe.)

32 8. A gél eltávolítása 8.1 Távolítsa el a szorító keretet és öntse bele a puffert a konténerbe. A puffer újrahasznosítható! 8.2 Fektesse le a gél kazettát a rövidebb felével fölfelé.

33 9. A gél vizsgálata 9.1   UV fény alatt vizsgálja meg, hogy megjelenik-e a zölden fluoreszkáló fehérje.     9.2 A kalibrációs görbe alapján határozza meg a molekuláris tömeget.

34 Sojabean Trypsin Inhibitor
9. A gél vizsgálata Protein color MW Myosin blue Da ß-Galactosidase magenta Da Bovine albumin green 83559 Da Carbonanhydrase violett 39559 Da Sojabean Trypsin Inhibitor orange 31405 Da Lysozyme red 17408 Da Aprotinine 7081 Da Táblázat: A fehérjék molekuláris tömege a Kaleidoszkóp standard-ban

35 Az elektro-forézis eredménye
-- KL P P KL -- Az elektro-forézis eredménye - kD 200 134 ? ? ? 84 40 31 17 7 + KL = Kaleidoszkóp fehérje standard; P1 = 1. minta; P2 = 2. minta

36 Az elektroforézis matematikai analízise
Vázoljon fel egy kalibrációs görbét a fehérje standard segítségével: Mérje meg a távolságot a nyílástól a fehérjevonalig.

37 A GFP molekuláris tömege: 27 000 Da
Eredmény A GFP molekuláris tömege: Da