Általános Genetika Mutációk.

Az előadások a következő témára: "Általános Genetika Mutációk."— Előadás másolata:

1 Általános Genetika Mutációk

2 A genetikai változatosság okai: rekombináció és mutáció
Mutációk = öröklődő változások vad típus mutáns mutáns allél, mutáns fehérje, mutáns sejt, mutáns egyed

3 A mutációk jelentősége
A legtöbb allél génmutációval keletkezik, és a természetes populációk genetikai változatosságának forrása. Az új allélek adják azt a nyersanyagot, amelyből az evolúció a szelekció útján kiválogatja a legalkalmasabbakat. A modern genetikában a mutációkat a gén szerepének tisztázására használjuk. Minden genetikai boncolás mutánsok gyűjtésével vagy előállításával kezdődik. A mutáns allélek mint markerek magának a mutációs eseménynek a tanulmányozására is felhasználhatók.

4 A mutációk csoportosítása az érintett DNS-régió nagysága szerint
Pontmutációk: nem lehet kimutatni hagyományos citogenetikai eszközökkel. Ezek általában egy gént érintenek (génmutáció) Kromoszóma-mutációk: több gént, akár teljes kromoszómákat érintenek. Legtöbbször a kromoszómák szintjén kimutathatók.

5 A mutációk csoportosítása a változás iránya szerint
Előremutató (forward) mutáció, ekkor az eredetitől (vad típustól) eltérő változat keletkezik. Visszamutató (reverse vagy back) mutáció, ez az eredeti (vad) genotípus vagy fenotípus visszaállását eredményezi. A visszaállás többféle módon történhet: pontos reverzióval, amikor az eredeti nukleotidsorrend helyreáll, egyenértékű reverzióval, amikor az új nukleotid az eredetitől különbözik, de hatására az eredeti funkció helyreáll, génen belüli szupresszor mutációval, amikor ugyanabban a génben egy második mutáció kompenzálja az első mutáció hatását, génen kívüli szupresszor mutációval, amikor egy másik génben megjelenő új mutáció kompenzálja az első mutáció hatását.

6 Génen belüli szuppresszió
Egy bizonyos fehérje biológiai aktivitásához szükséges konformációt egy Glu-Arg aminosav kölcsönhatás tartja fenn. Ha egy mutáció az Arg aminosav cseréjét eredményezi (pl. glutaminra), az a fehérje funkció elvesztéséhez, és ezért fenotípus változáshoz vezet. Ha az eredeti Arg aminosav közelében egy újabb mutáció bázikus aminosavat (pl. Lys) hoz létre, az képes lehet a fehérje biológiai aktivitását helyreállítani. Ez fenotípus reverzióhoz vezet. bázikus semleges aromás bázikus 6

7 Génen kívüli szuppresszió
tRNS Eredeti vad típus Amber (Stop) mutáció Amber szuppresszor mutáció mRNS AUG AUC Mutáció egy tRNS génben 7

8 A mutációk szövettípus szerinti csoportosítása
Szövetes szerveződésű élőlényekben Szomatikus vagy testi sejtekben keletkező mutáció Mutáns sejtklón, szektor (száma - hányszor, mérete – mikor) Mozaikos egyed Csíravonalban keletkező mutáció Ee × ee fekete szülő x sárga szülő utódok: Ee feketék ee sárgák és foltos: e > E szomatikus back mutáció

9 A szomatikus mutációk mozaikos fenotípust okoznak
A mutációt szenvedett testi sejtek utódai klónt alkotnak, és gyakran a többi sejttől elkülöníthető mutáns szektorként jelennek meg. A mutáns szektor mérete fordítva arányos a mutáció bekövetkezésének idejével.

10 A szomatikus és csíravonal sejtek mutációi
A természetben megfigyelhető változatosságot a csíravonal mutációk hozzák létre.

11 A mutációk fenotípus szerinti csoportosítása
Morfológiai (alaktani) mutációk minden olyan mutáció, amely az egyed morfológiáját (kinézetét) befolyásolja Letális (halálos) mutációk a leggyakrabban homozigóta formában vezetnek letalitáshoz Anyagcsere-mutációk Auxotróf mikrobák Ember veleszületett anyagcsere rendellenességei (például fenilketonúria, galaktozémia) Viselkedési mutációk Az állatok (és az ember) viselkedése jelentős részben genetikailag meghatározott, ezért azt mutációk megváltoztathatják Pl. a muslica udvarlási viselkedése megváltozhat akár a szárnyizmokat, akár azok beidegzését, akár az idegközpont szerkezetét befolyásoló mutációkkal. Kondicionális (feltételes) mutációk A kondicionális mutáció csak bizonyos környezeti feltételek, restriktív, azaz korlátozó körülmények között eredményez mutáns fenotípust. Más, permisszív, megengedő körülmények között vad fenotípus jön létre. Pl. hőérzékeny mutánsok, „érzékeny” életszakasz > az érintett gén működésére mikor van szükség.

12 A mutációk csoportosítása a génműködés megváltozása szerint
Funkcióvesztéses mutációk (loss of function, LoF) A DNS véletlenszerű változásának leggyakoribb következménye a génműködés sérülése. Ekkor a kódolt fehérje eredeti működése gátlódik vagy elvész. ha génműködés teljesen kiesik, „nulla allél” jön létre ha a vad típusú funkcióból valamennyi megmarad, azt homozigóta formában leaky (sánta) fenotípus jelzi A funkcióvesztéses mutációk általában recesszívek (a gén egyetlen sértetlen példánya a vad fenotípus kialakításához elegendő terméket termel). Domináns is lehet, ha: egyetlen ép génpéldány nem elegendő a vad fenotípus kialakításához (haplo-elégtelenség, haplo insufficiency) domináns negatív mutációk (a vad alléllal szemben mutatott dominancia oka az, hogy a funkció-vesztett géntermék gátolja az ép géntermék működését) Funkciónyeréses mutációk (gain of function, GoF) Megváltozott működés (új funkció vagy fokozott aktivitás) Általában domináns a vad alléllal szemben

13 Mi mozgatja az örökítő anyag természetes megváltozását?
Erre a kérdésre 1943-ig két egyenértékű magyarázat létezett. 1. A környezet változása kiválthatja a hozzá alkalmazkodó formák (változatok) megjelenését. 2. Az öröklődő változatok véletlenszerűen a környezettől függetlenül jelenhetnek meg. Salvadore Luria és Max Delbrück 1943-ban végzett „fluktuációs teszt” kísérlete azt igazolta, hogy a második magyarázat a helyes.

14 A fluktuációs teszt Az Escherichia coli egyik fágja a T1 fág.
Ha egy baktérium táptalajt tartalmazó lemezre sok (109) baktérium és T1 fág keverékét szélesztjük, a fágok az összes baktériumot elpusztítják. Ilyen körülmények között nem tapasztalunk baktérium növekedést. Ritkán azonban egy-egy fágnak ellenálló (rezisztens) telep nő ki. A rezisztens telep sejtjei egyetlen rezisztens sejt leszármazottai, tehát a rezisztencia öröklődik. A két lehetséges magyarázat: 1. A rezisztenciát a fág jelenléte váltja ki kis gyakorisággal valamilyen élettani változáson keresztül. 2. A rezisztencia a fágoktól független mutációval jön létre.

15

16 A fluktuációs teszt kísérlet

17 1. Adaptáció, a rezisztenciát a fág jelenléte váltja ki
Ha a rezisztenciát a fágok váltják ki, akkor minden baktérium csekély, de azonos valószínűséggel rezisztenssé válhat a fág hatására, ez azonban csak a szélesztés után történhet. Ekkor a rezisztens sejtek száma csakis a baktériumok és a fágok számától függ. Így azonos baktérium és fágszám mellett minden tenyészetben hasonló számú rezisztens sejt keletkezését várnánk. Más szóval, a rezisztensek száma tenyészetenként nem változik, „ nem fluktuál”.

18 2. A rezisztencia a fágoktól független véletlenszerű
mutációval jön létre Amennyiben a rezisztencia a fágoktól független véletlen mutációk eredménye, akkor annak megjelenése a fággal való találkozás előtt, a kémcsőben rázatás során következik be, és a növekedés korai és késői stádiumában egyaránt bekövetkezhet. Ha korán következik be, akkor a tenyésztés végére sok, ha későn következik be, akkor kevés rezisztens utód sejt lesz a tenyészetben. Más szóval a rezisztensek száma azonos baktérium és fágszám mellett is tenyészetenként változik, „fluktuál”.

19 A fluktuációs teszt eredménye
A nagy kultúrából szélesztett baktériumok között a rezisztensek száma minden petricsészében közel azonos. A külön-külön növesztett baktériumkultúrák a rezisztens telepek számában jelentős eltéréseket mutatnak. A rezisztencia létrejötte tehát a fágoktól független véletlen mutációk következménye.

20 A rezisztens sejtek fágszelekció előtti jelenléte
közvetlenül is kimutatható Joshua és Esther Lederberg által kifejlesztett „replica plating” technika

21 Mutációs ráta (mutációs sebesség)
1 2 3 4 5 6 7 Azonos időegység alatt bekövetkező mutációk száma. Biológiai időegységként általában egy élőlény generációs idejét használjuk, vagy sejtosztódásokra normalizáljuk az újonnan létrejött mutációk számát. Pl. az ábra példáján a mutációs ráta 1/7 sejtosztódás.

22 Mutációs gyakoriság A mutációs gyakoriság az az arány, amivel egy bizonyos mutáció a sejtek vagy egyedek egy vizsgált populációjában előfordul. Pl. az ábra példáján a mutációs gyakoriság az utolsó sejt generációban 2/8 = 0,25 A nagyobb mutációs ráta nagyobb mutációs gyakoriságot eredményez.

23 A mutáns allélok keletkezésének molekuláris alapjai

24 1. Kromoszóma szintű mutációk
számbeli szerkezetbeli 2. Pontmutációk egy vagy néhány bázis: - cseréje - kiesése - beékelődése A pontmutáció érintheti egy gén kódoló szakaszát vagy szabályozó régióját

25 A báziscsere típusai Tranzíció purin csere purinra AG, GA
pirimidin csere pirimidinre TC, CT Transzverzió purin csere pirimidinre AT AC GT GC vagy pirimidin csere purinra CG CA TA TG 25

26 a változás a következő replikáció során rögzül
26

27 A mutációk kialakulásának okai
A mutációk keletkezhetnek az élőlény tekintetében belső és külső okokból A belső okokból származó mutációkat tekintjük spontán, a külső okokból származókat indukált mutációknak. A mutáció ritka jelenség. Gyakran nem állapítható meg, hogy a mutációt belső, vagy külső tényező hozta létre. Ilyenkor általában a mutációt spontán mutációnak tekintjük. 27

28

29 Spontán mutációk okai :
a bázisok alternatív formái (keto/enol, amino/imino tautomerizáció) > megváltoztatja a bázisok párosodási sajátságait a replikáció során a szálak elcsúszása következtében kisméretű inszerciók és deléciók keletkezése - a DNS szerkezeti változásai (pl. deamináció, amely a bázisok párosodási tulajdonságait változtatják meg)

30 Tautomerizáció Normál bázispárosodás (keto és amino formák)
A guanin enol formája timinnel, az adenin imino formája citozinnal, képes H-híd kialakítására. A citozin imino formája adeninnel, a timin enol formája pedig guaninnel képes H-híd kialakítására. A párosodási hiba a replikáció során az újonnan szintetizált szálban megmarad és állandósul

31 Inszerció és deléció keletkezése a replikáció során
új szál régi szál A következő replikáció során az inszerció/deléció fixálódik. 31

32 A lacI gén 140 spontán mutácójának megoszlása (J.Miller)
Mutációs forró pontok A lacI gén 140 spontán mutácójának megoszlása (J.Miller) A mutációs „forró pontok” sokszor ismétlődő szekvenciát tartalmaznak vad típus ’ - GT CTGG CTGG CTGG C - 3’ inszerció - GT CTGG CTGG CTGG CTGG C - deléció - GT CTGG CTGG C - 32

33 Nukleotidhármas ismétlődések és kiterjedésük (triplet expanzió)
A törékeny X kromoszóma szindróma (név: in vitro cytológiai kép – az X kr. adott ponton gyakran törik) a leggyakoribb öröklődő szellemi visszamaradottság (1/1500 férfi, 1/2500 nő) FMR-1 fehérje a szinaptikus plaszticitás folyamatában fontos – tanulás, memória Normális: FMR-1 (=fragile X mental retardation 1) génjében 60-nál kevesebb egymást követő CGG ismétlődés van az 5’ UTR-ben szoros ismétlődés legtöbbször nem okoz súlyos tüneteket (az esetek csak 20%-a súlyos) Beteg: FMR-1 génben CGG nukleotidhármas számfeletti ismétlődése alakul ki (az ismétlődések száma a betegekben több ezer is lehet) Következmény: - magasabb metiláltság, kromatin (?) > silencing - hosszú 5’UTR > transzláció gátlás Az ismétlődések kiterjedésének mechanizmusa nem ismert. Úgy tűnik, hogy 50 ismétlődés felett pontatlan az ember replikációs rendszere. 33

34 Több öröklődő betegség molekuláris hátterében áll a három nukleotid ismétlődés kiterjedése.
A törékeny X betegségen kívül ismétlődés kiterjedése figyelhető meg a Huntington betegségben is (CAG ismétlődik a Huntingtin gén kódoló régiójában > poliglutamin) Különböző betegségekben az ismétlődés érinthet kódoló és nem kódoló szakaszokat egyaránt. A nagyszámú ismétlődés a DNS szakasz fokozott metiláltságát eredményezi, ami az érintett gént inaktiválja. 34

35 Spontán léziók I.: depurinálódás, a glikozid kötés hasadása
A guanin (vagy adenin) lehasadásával apurinált hely marad, mely replikációkor nem határoz meg komplementert, így komoly genetikai veszélyt jelent. Hibajavító (repair) mechanizmus egy bázis beépítésével megszünteti az ilyen helyeket. Ez a véletlenszerű beépítés mutációt okozhat. 35

36 Spontán léziók II.: deaminálódás
A citozin uracillá alakulhat, mely replikációkor adeninnel párosodik, G-CA-T tranziciót okozva. Az uracil-DNS-glikoziláz repair enzim felismeri az uracilt és javítja a hibát. Az 5-metilcitozin deaminálása timint (5-metiluracilt) eredményez, melyet az uracil-DNS-glikoziláz nem ismer fel. Ez C-GT-A tranzicióhoz vezet . Az 5-metilcitozinoknál ezért mutációs forrópont alakul ki 36

37 külső okokból származó mutációk
Indukált mutációk külső okokból származó mutációk A természetes (spontán) mutációs ráta igen alacsony A mutációs ráta mesterséges módon jelentősen megemelhető. Ez mutációt okozó vegyszerekkel (mutagén anyagokkal), ionizáló sugárzással történhet Vegyszerek számos módon okozhatnak mutációkat: bázis analógok a DNS-be beépülnek, de nem a megfelelő bázissal párosodnak alkiláló, deamináló szerek, oxidáló anyagok a DNS bázisok szerkezetét és párosodási tulajdonságait megváltoztatják interkaláló szerek a bázisok közé ékelődnek és nukleotid inszerciót vagy deléciót okoznak Sugárzások

38 Az ionizáló sugárzások mutagén hatása
Az ionizáló sugárzások hatására a molekulák ionizált és gerjesztett állapotba kerülnek, melyek reagálhatnak a sejt komponenseivel, így a DNS-sel is. Az ionizáló sugárzás felbonthatja az N-glikozid kötést, mely apurinált/apirimidinált helyet eredményez, de kétszálú törések is történhetnek. Mindkét jelenség mutációk kialakulását indukálja, pontmutációkhoz, kromoszóma átrendeződésekhez vezethet. 38

39 Bázis analógok a természetes bázisokhoz hasonló szerkezetűek, a DNS polimeráz a kettős spirálba beépíti pl. 5-brómuracil (5BU) timin analóg adeninnel és guaninnal is (!) képes párosodni tranziciót okoz T-A>5BU-A>5BU-G>C-G C-G>5BU-G>5BU-A>T-A 2-aminopurin (2AP) adenin analóg a timinen kívül citozinnal is (!) képes párosodni tranziciót okoz T-A>T-2AP>C-2AP>C-G C-G>C-2AP>T-2AP>T-A

40 Bázismódosítók: Alkiláló szerek
alkil (-CH3, -CH2-CH3) csoportokat építenek a nukleinsavak bázisaira és azokat módosítják pl. etil-metánszulfonát (EMS) főként a guanint, kisebb mértékben a timint módosítja a 6-etilguanin timinnel párosodik, ami C-G>T-A tranzíciót eredményez a 4-etil-timin a guaninnal párosodik, és így T-A>C-G tranzíció jön létre

41 Bázismódosítók: Deamináló szerek
a spontán deamináción kívül különböző vegyszerek is képesek a bázisok amin csoportjait támadni pl. salétromossav a citozint, az adenint és a guanint támadja citozin uracil, mely a következő replikáció során adeninnel párosodik és C-G > T-A tranziciót okoz adenin hipoxantin, ami citozinnal párosodva T-A > C-G tranziciót eredményez

42 Bázismódosítók: Hidroxilálószerek
A hidroxilamin (HA,= NH2OH) hidroxilálja a citozin C-4 pozícióban levő amino-nitrogénjét, mely így adeninnel fog párosodni. Ezzel C:GT:A tranziciót indukál. 42

43 Interkaláló vegyületek
- általában gyűrűs vegyületek, melyek térkitöltése a bázispárokhoz hasonlít - a DNS kettős spirálban egymás melletti bázispár közé képesek beépülni - a beépülés a kettős spirál alakját torzítja, ami azután a replikáció során egy nukleotid kiesését vagy beépülést okozza > frame-shift mutációt okoznak ha keresztkötik a DNS két szálát, az többé nem tud replikálódni. pl. proflavin akridin sárga etidium-bromid Aktinomicin-D dioxin-származékok

44 Aflatoxin mikotoxin (gombaméreg), amelyet penészgombák termelnek (Aspergillus fajok) Erős mutagén, a guanin N-7-hez való kapcsolódás után apurinált hely keletkezik. Afrika és Kelet-Ázsia területén előforduló májrák leggyakoribb okozója. 44

45 45

46 Azokat a vegyszereket, amelyeknek az akut toxicitása vagy sterilizáló hatása elhanyagolható, de hatékony mutagének, szupermutagéneknek nevezzük.

47 Mutációs nemesítés Mutagén kezeléssel a különböző tulajdonságú genetikai variánsok száma megsokszorozható. Ezek között kedvező tulajdonságúak is lehetnek. A mezőgazdasági nemesítés ezért a mutagén kezelést is felhasználja új tulajdonságú fajták előállítására. Mind a pollen, mind a mag kezelhető mutagénekkel.

48 Mutánsok izolálása állati és növényi sejttenyészetekből
Növények vagy állatok sejtjei a mikrobákhoz hasonlóan tenyészthetők és szelektálhatók tápfolyadékban. Mivel ilyenkor egy sejt egy egyednek tekinthető, íly módon nagy egyedszám szelekciójával kis gyakoriságú biokémiai mutációs események is kimutathatók. A szelektált növényi sejtekből kallusz tenyészthető, majd hormon kezeléssel növény nevelhető a kalluszból. A növény hordozza a szelektált tulajdonságot.

49 Mutációs nemesítéssel előállított dísznövény változatok

50 Mutációk hatása a géntermékre
csendes (silent, szinoním) mutáció: A triplet utolsó bázisa változik, de ugyanazt kódolja AGT (Ser) AGC (Ser) semleges (neutrális, konzervatív) mutáció: A kódolt aminosav hasonló jellegűre változik, ezért a fehérje szerkezetét és funkcióját nem feltétlenül érinti AAA (Lys bázikus) AGA (Arg bázikus) misszensz („megváltozott értelmű”) mutáció: Egy báziscsere miatt másik, nem funkcióképes aminosav kódja keletkezik GAG (Glu savas) GTG (Val semleges) Nonszensz („értelmetlen”) mutáció: Egy báziscsere miatt STOP kodon keletkezik TAC (Tyr) TAG (Stop) Kereteltolódási (frame shift) mutáció: Egy vagy két bázis kiesése vagy hozzáadódása miatt elcsúszik a leolvasási keret A 50

51

52

53 Pontmutáció érinthet splicing helyet
- módosul a fehérje hossza - in frame STOP-kodon is lehet a ki nem vágódó intronban

54 DNS hibák javító mechanizmusai, REPAIR mechanizmusok
A DNS hibái többféle mechanizmussal javítódnak. A javítás a DNS kettős spirál szerkezetén alapszik. A javítási mechanizmusok redundánsak, azaz egy hibát több mechanizmus képes kijavítani. Ez többszörös biztonságot jelent.

55 A DNS javító mechanizmusok csoportosítása
- A párosodási hibák javítása (Mismatch repair) - Közvetlen javítás - Bázist kivágó javítás Nukleotid eltávolító javítás Rekombinációs javítás …

56 Mutátorok és az ember repair betegségei
Ha a hibajavító fehérjéket kódoló génekben mutáció következik be, a DNS hibák javítása szenved kárt, így több hiba halmozódik fel a DNS-ben. Ennek következménye egysejtűekben nagyságrendekkel magasabb mutációs ráta, többsejtűekben rák betegség kialakulása. Ezért ezeket a géneket mutátor géneknek is nevezik.

57 Mutagén – Karcinogén a halálozások oka a civilizált világban 40%-ban rákos daganat - a rákos megbetegedések közel 90%-át a környezetünket szennyező mutagének okozzák - a mutagén vegyületek rákkeltők (karcinogén) is - évente néhány ezer olyan vegyületet állítanak elő, amelyek korábban nem léteztek a Földön (gyógyszer alapanyagok, növény- vagy faanyagvédő szerek, élelmiszer-adalék, kozmetikum, háztartási vegyszer stb.) A mutagének és a karcinogének közötti szoros kapcsolat szükségessé teszi a környezetünkben lévő mutagén vegyületek kimutatását

58 A genotoxicitás mérése
A mutációt okozó anyagok kimutatására olyan tesztrendszer szükséges, amely hatékonyan láthatóvá tesz sok különböző lókuszban bekövetkező új funkció vesztéses recesszív mutációt is. Soksejtű eukariótákban ez nehezebb, az első ilyen rendszert mégis muslicában dolgozta ki Herman J. Müller 1928-ban (Drosophila ClB teszt). többféle, nemzetközileg elfogadott tesztrendszer: bakteriális tesztek (Salmonella typhimurium, Esherichia coli) mikroszkópikus gombák (pl. Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus nidulans) rovarok (ecetmuslica Drosophila melanogaster) növények (lóbab, árpa, vöröshagyma) gerincessejt-vonalak (humán és egyéb emlős sejtvonalak) in vivo emlős (egér, hörcsög, patkány)

59 Salmonella typhimurium
Bakteriális reverz mutagenitási teszt Kidolgozója, Bruce Ames után AMES teszt Validált (OECD Guideline 471) Pontmutációk észlelésére alkalmas Salmonella typhimurium apatogén, mutáns törzseinek használatán alapul nagy populációban bekövetkező ritka mutációs esemény detektálása

60 Számoljunk! Spontán mutációs gyakoriság: baktériumból néhány tucat mutáns Indukált (mutagén ágens hatására): baktériumból néhány száz mutáns 9 900 telep telep Cél: teremtsünk olyan kísérleti körülményeket, ahol a baktérium NEM, míg a közötti számban előforduló mutáns életképes (telepet képez) mutagénnel kezelt spontán

61 A Salmonella reverz mutagenitási teszt alapja
his- mutánsainak reverzióját méri a tesztelendő vegyületek hatására MUTAGÉN TESZTTÖRZS Reverzió = back mutáció his+ hisztidint szintetizál (hisztidint NEM tartalmazó tápközegben életképes) his- hisztidin bioszintézisére képtelen (hisztidint NEM tartalmazó tápközegben életképtelen) hisztidin-mentes táptalajon mutagénnel kezelt spontán

62 Hisztidin bioszintézis
phosphoribosyl pyrophosphate

63 A teszttörzsek jellegzetességei
Különböző típusú his mutációkat tartalmaznak, ezért a mutáció reverziója történhet: bázispár szubsztitúcióval frame-shift segítségével különböző hatásmechanizmusú mutagén vegyületek mutathatók ki, azaz információt nyújt a genotoxikus anyagok által előidézett mutációk típusáról A tesztelő törzsek hibásak az: LPS kialakításában rfa (lipopoliszacharid bioszintézis, sejtfelszín), a vizsgálandó anyag könnyebben jut be a sejtbe a sejtfalon át excíziós repairben uvr (érzékenyebb kimutatás)

64 A kísérlet kivitelezése I.
S9 – patkány májából készült kivonat (mikroszomális frakció – ER – drogmetabolizmus enzimei S9-et adagolva modellezni lehet az emlősökben lezajló enzimatikus reakciókat, így a bakteriális géntoxikológiai tesztekből következtethetünk a szennyezőanyagok magasabb rendű szervezetekre gyakorolt hatására

65 A kísérlet kivitelezése II.

66 Az eredmények értékelése
Egy vegyületre akkor mondjuk, hogy Ames-tesztben nem mutagén, amennyiben legalább 4 törzsön – TA98, TA100, TA1535, TA97 és/vagy TA1537 – bizonyította önmagában vagy S-9-es aktiválás utáni hatástalanságát. Egyetlen törzsön mért pozitív teszt esetén is mutagén a minősítés. Az aflatoxin Ames tesztje

67 Továbbfejlesztett Ames teszt
96 lukú mikrotitráló lemezen 6 törzzsel (TAMix) végezhető egyszerre pH indikátor festék a tápközegben (brómkrezol lila) A hisztidinmentes tápközegben szaporodó (revertált) baktériumok savasítják a tápközeget

68 A Müller féle ClB mutagén teszt
Herman J. Müller dolgozta ki 1928-ban A teszt vad fenotípusú hímek hordozta X kromoszómán vizsgálja letális mutációk keletkezését. A kimutatási rendszerhez egy speciális X kromoszómát szerkesztett. Ez a ClB kromoszóma. A C a crossing-overt gátló inverziót jelöli. „l” egy recesszív letális allél. „B” a Bar, azaz a rés-szem domináns allélja.

69 A Müller féle ClB mutagén teszt
(mutagén Röntgen sugárzás) P + Y ClB + X F1 Bar szemű nőstények > egyik X kromoszómájuk a ClB

70 A Müller féle ClB mutagén teszt
(mutagén Röntgen sugárzás) P + Y ClB + X + Y ClB + ClB + + Y F1 X X

71 A Müller féle ClB mutagén teszt
(mutagén Röntgen sugárzás) P + Y ClB + X + Y ClB + ClB + + Y F1 X X F2 ClB Y + Y + ClB + ClB Y + Y + ClB + letális életképes letális letális Az F1 keresztezések egyetlen nőstényt tartalmaznak. Amennyiben az F1 nőstény X kromoszómája újonnan indukált letális mutációt hordoz, (pirossal szimbolizálva) akkor utódai között nem lesznek hímmek. A mutációs gyakoriság a hímeket nem tartalmazó és hímeket tartalmazó F2 nemzedékek arányából kiszámítható.

72 A kapcsolt-X (attached-X) kromoszómás teszt
(mutagén EMS) P X X Y + Y X

73 A kapcsolt-X (attached-X) kromoszómás teszt.
(mutagén EMS) P X X Y + Y X X X + X X Y Y + Y F1 letális letális életképes életképes

74 A kapcsolt-X (attached-X) kromoszómás teszt.
(mutagén EMS) P X X Y + Y X X X + X X Y Y + Y + Y F1 letális letális életképes életképes letális vagy A ClB módszernél egyszerűbben kivitelezhető, egy generációs teszt a mutagének minősítéséhez. Az F1 nemzedék hím és nőstényeinek aránya kezelés nélkül 1 : 1. Az X kromoszómát ért letális mutációk az F1 hímek arányát csökkentik. Az F1 hímek és nőstények arányából kiszámítható a mutációs gyakoriság.