Penicillin származékok szabadgyökös reakciói

Az előadások a következő témára: "Penicillin származékok szabadgyökös reakciói"— Előadás másolata:

1 Penicillin származékok szabadgyökös reakciói
Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar Oláh György Doktori Iskola Magyar Tudományos Akadémia Energiatudományi Kutatóközpont Energia- és Környezetbiztonsági Intézet Sugárkémiai Laboratórium Penicillin származékok szabadgyökös reakciói Szabó László  PhD hallgató .OH .OH Témavezető: Dr. Tóth Tünde (egyetemi docens) Konzulens: Prof. Takács Erzsébet (osztályvezető)

2 Bevezetés Szabadgyökös reakciók I. Szabadgyökök in vivo keletkezése
Oxigén-függő életmódunk következménye Káros és létfontosságú folyamatok irányítása II. Szabadgyökök in vitro előállítása Nagyhatékonyságú oxidációs eljárások Cél: Szennyvízben található szennyezők lebontása

3 Bevezetés Szabadgyökös reakciók biológiai jelentősége

4 Bevezetés Szabadgyökös reakciók biológiai jelentősége
Oxidatív stressz előidézése külső hatással Ionizáló sugárzás (OH) UV sugárzás (OH) Redox ciklust folytató vegyületek kinonok, viologének (doxorubicin, paraquat) Baktericid antibiotikumok aminoglikozidok, kinolonok, penicillin származékok

5 Célkitűzések Szabadgyökös reakciók biológiai jelentősége
Célkitűzés I. A hidroxil gyök (OH) által előidézett oxidáció mechanizmusának feltárása egy modellként szolgáló penicillin származékon. Célkitűzés II. Penicillin származékok egy-elektron redukciója az oxidatív stressz jelenséggel kapcsolatban.

6 Reaktív köztitermékek
Bevezetés Szabadgyökös reakciók kémiai technológiai jelentősége Nagyhatékonyságú oxidációs eljárások Sorszám Módszer Reaktív köztitermékek 1 Ózonos kezelés O3 vagy O3/H2O2 •OH, HO2•/ O2• ‾, O3• ‾ 2 Fenton eljárás H2O2/Fe2+ vagy H2O2/O3/Fe2+ (savas közeg) 3 Foto-Fenton eljárás UV-fényt használva •OH 4 Fotooxidáció UV (λ = 185nm és 254 nm) vagy UV/O3, UV/H2O2 vagy UV/O3/H2O2 alkalmazásával 5 Fotokatalitikus eljárás: UV/Vis fénnyel TiO2, ZnO... katalizátorokat használva 6 Ionizáló sugárzások alkalmazása: gyorsított elektronokat, γ-sugárzást, röntgen-sugárzást felhasználva; fokozódó hatás O3/O2, végül H2O2, mint adalékanyag jelenlétében •OH, HO2•/ O2• ‾, O3• ‾, eaq─, H• 7 Elektrokémiai oxidáció •OH  8 Ultrahangos kezelés (szonolízis) •OH, H• Wang, J. L.; Xu, L. J. Crit. Rev. Env. Sci. Tec. 2012, 42,

7 „Forró pont (hot spot)”
Bevezetés Szabadgyökös reakciók vegyészmérnöki jelentősége Antibiotikumok, mint potenciális vízszennyezők Antibiotikum rezisztencia Letális dózis alatti antibiotikum koncentráció Nagy és diverz baktérium populáció Szelektív nyomás „Forró pont (hot spot)” De novo gén mutáció Horizontális gén transzfer Darwini szelekció és túlélés törvénye 6 Rizzo, L.; Manaia, C.; Merlin, C.; Schwartz, T.; Dagot, C.; Ploy, M. C.; Michael, I.; Fatta-Kassinos, D. Sci. Total Environ. 2013, 447,

8 Célkitűzések Szabadgyökös reakciók vegyészmérnöki jelentősége
Antibiotikumok eltávolítása szennyvizekből – a fenntartható jövő felé Célkitűzés III. A penicillin származékok β-laktám gyűrűjének lebontása az antibakteriális aktivitás eltávolítása céljából. Célkitűzés IV. Az oxidáció során képződő termékek hatása baktérium törzsekre. Célkitűzés V. Penicillin származékok egy-elektron oxidációs mechanizmusa a nagyhatékonyságú oxidációs eljárások tekintetében. OH és Cl2−/Br2− Cl2−/Br2− a OH és a Cl−/Br− közötti reakcióban képződnek

9 Kísérleti módszerek Kísérleti módszerek + 2 H+ + +
H3O+ Szabadgyökös reakciók előidézésének alapja: a víz radiolízise H2O Elektron sugár H2O H2O  + H2O OH H2O e− H2O H2O H2O H3O+ γ-foton e− H2O  + OH H2O2 H2O H2O H2O H2O* OH H2O eaq− + 2 H+ H2O H2 H2O + eaq− H2O  H +  H Hidratált elektron Hidrogén atom

10 Levegőn végzett kísérlet
Kísérleti módszerek Szabadgyökös reakciók előidézésének alapja: a víz radiolízise G [μmol J-1]  N2O-dal telített (pH 3-11) N2-nel telített (pH 3-11) O2-nel telített Levegőn végzett kísérlet N2O-dal telített (pH = 2) G(OH) 0,56 0,28 0,40 G(H2O2) 0,09 0,07 0,136* ~ 0,08 G(eaq−) - G(H) 0,06 0,22 G(O2−/HO2) 0,33 G(H2) 0,05 c [mmol dm-3] [O2] ~ 1,35 ~ 0,27 [N2O] ~ 20 OH + (CH3)3COH → H2O + CH2C(CH3)2OH N2O + eaq + H2O → N2 + OH + −OH 2 HO2 → H2O2 + O2 HO2 + O2 + H2O → H2O2 + O2 + −OH eaq− +O2 → O2− H + O2 → HO2 eaq + H+ → H k = 2,3 × 1010 mol-1 dm3 s-1 k = (8,3  0,7) × 105 mol-1 dm3 s-1 k = 9,1 × 109 mol-1 dm3 s-1 k = 6 × 108 mol-1 dm3 s-1 k = 1,9 × 1010 mol-1 dm3 s-1 HO2 ↔ O2− + H+ pKa = 4,8 N2O + eaq + H2O → N2 + OH + −OH k = (9,7  0,6) × 107 mol-1 dm3 s-1 k = 9,1 × 109 mol-1 dm3 s-1 k = 1,2 × 1010 mol-1 dm3 s-1 von Sonntag, C. Free-Radical-Induced DNA Damage and Its Repair. A Chemical Perspective; Springer: Heidelberg, 2006. *Ghormley, J. A.; Hochanadel, C. J. J. Am. Chem. Soc. 1954, 76, Buxton, G. V.; Greenstock, C. L.; Helman, W. P.; Ross, A. B. J. Phys. Chem. Ref. Data 1988, 17,

11 Kísérleti módszerek Folyamatos γ-besugárzás
Dozimetria: etanol-klórbenzol doziméter (ISO/ASTM 51538:2009)

12 Kísérleti módszerek Folyamatos γ-besugárzást követő mikrobiológiai vizsgálatok Folyamatos γ-besugárzást követő végtermék analízis Akut és krónikus toxicitás teszt Vibrio fischeri Agricultural Research Service Culture Collection, NRRL- B-11177, Hach Lange GmbH, Düsseldorf, Németország DIN EN ISO szabvány szerinti teszt LUMIStox 300 Lumineszcencia intenzitás (480 nm) Abszorbancia (485 nm) Baktérium érzékenységi tesztek: Gram-pozitív és Gram-negatív törzsek Agar diffúziós teszt Staphylococcus aureus (ATCC 6538) American Type Culture Collection (ATCC) Bacillus subtilis (ATCC 6633) Escherichia coli (ATCC 25922) Tápoldat higítási teszt RABIT impedimetriás készülék (Don Whitley Scientific, Egyesült Királyság) Spektroszkópia UV-Vis abszorpciós spektrumok felvétele: Jasco 550 spektrofotométer FTIR spektrumok felvétele: Unicam Mattheson Research Series 1 13C NMR spektrum (500 MHz) felvétele: Bruker DRX-500 Avance spektrométer Kromatográfia LC/ESI-MS és LC/ESI-MS/MS analízis: Agilent 1200 folyadékkromatográf 2,1 mm x 100 mm-es Phenomenex Kinetex XB-C18 kolonna Agilent 6410 triple quadrupole MS/MS elektrospré ionizációs illesztőegységgel Összegparaméter Teljes szerves széntartalom mérése: Shimadzu TOC-L berendezés CO2-felszabadulás közvetett meghatározása

13 Kísérleti módszerek I. Folyamatos γ-besugárzást követő mikrobiológiai vizsgálatok Inkubálás T = 37 °C t = 24 h Beoltás Agar öntés Lyuk készítés 1 ml 106 CFU/ml 100 µl antibiotikum minden lyukba Kiértékelés Termék analízis (LC/MS) Beoltás 0,5/1 ml minta hozzáadása 0,5 ml 107 CFU/ml Higítási sor készítése foszfát pufferben (pH 7) Három párhuzamos minta Impedancia tápközeg Antibiotikum minta RABIT impedimetriás készülék γ-besugárzás Inkubálás T = 37 °C; t = 24 h 12

14 Kísérleti módszerek IMPULZUSRADIOLÍZIS Tesla Linac LPR-4 Katód
Beton fal - árnyékolás Katód Impulzus hossz: 800 ns Pulzusonkénti dózis: Gy Elektron energia: 4 MeV Dozimetria: 0,01 M KSCN oldat Fotoelektron-sokszorozó Gyorsító cső Magnetron Digitális oszcilloszkóp Optikai kábel 325 Monokromátor Lencse Oldat Kvarc küvetta Számítógép Fényzár Xenon lámpa

15 Eredmények és értékelésük
1. Reakciómechanizmus feltárása: reakciósebességi állandók Köztitermék képződésének követése 1. Reakciómechanizmus feltárása: reakciósebességi állandók OH + Amoxicillin → termékek dOH  = (k1 + k2 +….kn)AMXOH = kAMXOH = k' OH dt OH = OH0exp(-k't) dX  = kxAMXOH = kx' OH = kx' OH0exp(-k't ) kx X =  OH0 (1 exp(-k't )) A = A(1 exp(-k't )) k 13

16 Eredmények és értékelésük
1. Reakciómechanizmus feltárása: reakciósebességi állandók Kompetíciós technika OH + SCN (+SCN) OH + (SCN)2 (1) OH + Amoxicillin → termékek (2) [ (SCN) 2 ]0 [ (SCN) 2 ] =1+ 𝑘 2 [AMX] 𝑘 1 [SCN] k1 = 1,05 × 1010 mol-1 dm3 s-1 k2 14

17 Eredmények és értékelésük
1. Reakciómechanizmus feltárása: reakciósebességi állandók A reaktáns fogyásának követése: ha a reaktáns karakterisztikus elnyeléssel és megfelelően nagy moláris fényelnyelési együtthatóval rendelkezik: eaq : 𝜆max = 720 nm; ε = mol-1 dm3 cm-1 * Cl2− : 𝜆max = 340 nm; ε = 9600 mol-1 dm3 cm-1 ** OH + Cl− ↔ ClOH− (1) k1 = 4,3 × 109 mol-1 dm3 s-1 k-1 = 6,1 × 109 s-1 ClOH− + H+ ↔ (HOClH) (2) k2 = 3 × 1010 mol-1 dm3 s-1 k-2 = 1 × 108 s-1 (HOClH) ↔ Cl + H2O (3) k3 = (5  2) × 104 s-1 k-3 = 2,5 × 105 s-1 Cl− + Cl ↔ Cl2− (4) k4 = 8,5 × 109 mol-1 dm3 s-1 k-4 = 6 × 104 s-1 K4 = 1,4 × 105 mol-1 dm3 Cl2− + H2O ↔ (HOClH) + Cl− (5) k5 = 1300 s-1 k-5 = (8  2) × 109 mol-1 dm3 s-1 Cl2− + OH− → ClOH− + Cl− (6) k6 = 4 × 106 mol-1 dm3 s-1 Cl2− + Cl2− → Cl2 + 2 Cl− (7) logk7 = 8, × I1/2/(I1/2+1) Cl2 + H2O → ClOH + Cl− + H (8) k8 = 11 s-1 Cl2 + Cl− ↔ Cl3− (9) K9 = 0,18 mol-1 dm3 Cl2− + penicillinek → termékek (10) k10 = ?? Cl + penicillinek → termékek (11) k11 = ?? * Hare, P. M.; Price, E. A.; Bartels, D. M. J. Phys. Chem. A 2008, 112, ** Bielski, B. H. J. Radiat. Phys. Chem. 1993, 41,

18 4-Hidroxi-D-fenil-glicin
Eredmények és értékelésük 1. Reakciómechanizmus feltárása: reakciósebességi állandók A reaktáns fogyásának követése: Cl2− k’ = k5 + k-3/(K4[Cl−]) + {k11/(K4[Cl−]) + k10}[Penicillinek] kOH (mol-1 dm3 s-1) keaq- kCl2− (mol-1 dm3 s-1) Ampicillin 9,0 × 109 5,5 × 109 - Kloxacillin 7,9 × 109 Amoxicillin 7,0 × 109 5,2 × 109 1,6 × 109 6-Aminopenicillánsav ~ 1010 (diffúzió kontrollált) 8,8 × 109 1,3 × 109 4-Hidroxi-D-fenil-glicin 1,0 × 1010 1,5 × 109 2,8 × 108

19 Eredmények és értékelésük
1. Reakciómechanizmus feltárása: köztitermékek azonosítása Tranziens spektrum felvétele >S.˙.S< A spektrum az egyes gyökök spektrumainak lineárkombinációja Δ𝐴(λj)= 𝑖=1 𝑛 𝜀𝑖 λj 𝑐𝑖 l

20 Eredmények és értékelésük
1. Reakciómechanizmus feltárása: köztitermékek azonosítása Átlapoló spektrumok: Az egyik komponens eliminálása a rendszerből Dihidroxiciklohexadienil típusú gyök oxidációja

21 Eredmények és értékelésük
1. Reakciómechanizmus feltárása: köztitermékek azonosítása Nincs jellemző elnyelés Redox titrálás Redukáló tulajdonságú α-aminoalkil gyökök MV2+ + -C-N< MV+ + -C=N+< *E° (MV2+/MV+) = -0,448 V MV+ * * λmax = 600 nm * * ε600 = mol-1 dm3 cm-1 *Wardman P. J. Phys. Chem. Ref. Data 1989, 18, 19 **Trudinger, P. A. Anal. Biochem. 1970, 36,

22 Eredmények és értékelésük
1. Reakciómechanizmus feltárása: amoxicillin szabadgyökös oxidációja:  OH I. OH kOH = 7  109 mol1 dm3 s1 OH addukt élettartama (τ): ~ 0,6 µs (CH3SCH3) ~ 3 ms !! III. II. G = 0,09 μmol J-1 (16%) G = 0,11 μmol J-1 (20%) -H2O O2 / Fe(CN)63- [ox] V. IV. VI.

23 Eredmények és értékelésük
1. Reakciómechanizmus feltárása: amoxicillin szabadgyökös oxidációja:  OH e- VI. -H+ VII. IX. XII. -CO2 VIII. X. XI. G = 0,17 μmol J-1 (30%)

24 Eredmények és értékelésük
2. Antibakteriális aktivitás eltávolítása: a, kémiai megközelítés Az antibakteriális aktivitás szerkezeti követelményei: Kezelt minták (0,8 kGy) LC/ESI-MS/MS vizsgálata A β-laktám tartalom meghatározása: FTIR mennyiségi analízis (KSCN belső standard) Polárosabb termékek Polárosabb termékek 2067 cm-1 G(Amoxicillin) = 0,1 µmol J-1 G(Ampicillin) = 0,32 µmol J-1 G(Kloxacillin) = 0,08 µmol J-1 1765 cm-1 22

25 Eredmények és értékelésük
2. Antibakteriális aktivitás eltávolítása: b, mikrobiológiai megközelítés Táptalaj higítási teszt , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , 24

26 Tézisek Igazoltuk, hogy a hidratált elektron a penicillin váz β-laktám gyűrűjén, az amidfunkció karbonilcsoportján, valamint a karboxilcsoport szénatomján támad. Az egy-elektron redukció köztitermékei ketil gyökök. (1. közlemény) Impulzusradiolízis módszer alkalmazásával megállapítottuk, hogy az amoxicillin molekulában a tioéter egység érzékenyebb a hidroxil gyök támadására, mint az antibiotikum aromás gyűrűje. Az amoxicillin hidroxil gyök által előidézett oxidációja tehát követi a szerves szulfidokra jellemző reakcióutat. (2. közlemény) A hidroxil gyök által előidézett reakció mechanizmusának feltárásán keresztül impulzusradiolízis technikát alkalmazva bebizonyítottuk, hogy egy rövid életű és egy stabilizált hosszú életű hidroxil gyök-kén addukt képződik az amoxicillin esetében. (2. közlemény) 22

27 Tézisek A hidratált elektron és a hidroxil gyök nagy hatékonysággal képes lebontani az amoxicillin β-laktám gyűrűjét. Ezt IR spektroszkópiai vizsgálatokkal és kinetikai mérésekkel támasztottuk alá. (3. közlemény) Végtermék-vizsgálatokkal egybekötött mikrobiológiai mérések segítségével bizonyítottuk, hogy a penicillinek kezelése nagyhatékonyságú oxidációs eljárással előállított kis és nagy gyökkoncentráció alkalmazásával veszélyezteti a baktériumokra ható szelektív nyomás megszüntetését. (4. közlemény) Impulzusradiolízis vizsgálatokkal alátámasztottuk, hogy a penicillinek egy-elektron oxidációja főként a kénatomon játszódik le mind Cl2−/Br2−, mind hidroxil gyök alkalmazása esetén. Megállapítottuk továbbá, hogy a penicillinek jelentős reaktivitással rendelkeznek a Cl2−/Br2−-nal. Nagyobb kén gyökkation koncentráció tapasztalható Cl2−/Br2− alkalmazása esetén, mint a csak hidroxil gyökkel végzett kísérletekkel, mivel a hidroxil gyök előidézte oxidáció során stabilizált köztitermék keletkezik. (2. és 5. közlemény)

28 Az értekezés alapját képző közlemények:
Szabó, L.; Tóth, T.; Takács, E.; Wojnárovits, L. One-electron reduction of penicillins in relation to the oxidative stress phenomenon. International Journal of Molecular Sciences 2015, 16, [IF: 3,257] Szabó, L.; Tóth, T.; Rácz, G.; Takács, E.; Wojnárovits, L. Drugs with susceptible sites for free radical induced oxidative transformations: the case of a penicillin. Free Radical Research 2016, 50, [IF: 2,949 (2015)] Szabó, L.; Tóth, T.; Rácz, G.; Takács, E.; Wojnárovits, L. OH and eaq are yet good candidates for demolishing the β-lactam system of a penicillin eliminating the antibacterial activity. Radiation Physics and Chemistry 2016, 124, [IF: 1,207 (2015)] Szabó, L.; Tóth, T.; Engelhardt, T.; Mohácsi-Farkas, Cs.; Rácz, G.; Takács, E.; Wojnárovits, L. Change in hydrophilicity of penicillins during advanced oxidation by radiolytically generated OH compromises the elimination of selective pressure on bacterial strains. Science of the Total Environment 2016, , [IF: 3,976 (2015)] Független idéző: 1. Szabó, L.; Tóth, T.; Takács, E.; Wojnárovits, L. One-electron oxidation of molecules with aromatic and thioether functions: Cl2−/Br2− and OH induced oxidation of penicillins studied by pulse radiolysis. Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry 2016, 326, [IF: 2,477 (2015)] 24

29 További közlemények: Szabó, L.; Mile, V.; Tóth, T.; Balogh, Gy. T.; Földes, T.; Takács, E.; Wojnárovits, L. On the complex free radical chemistry of arylalkylamines with special emphasis on the contribution of the alkylamine side chain. Physical Chemistry Chemical Physics 2016, Beküldve. [IF: 4,449] Szabó, L.; Tóth, T.; Homlok, R.; Rácz, G.; Takács, E.; Wojnárovits, L. Hydroxyl radical induced degradation of salicylates in aerated aqueous solution. Radiation Physics and Chemistry 2014, 97, [IF: 1,380] Független idéző: 1. Szabó, L.; Tóth, T.; Homlok, R.; Takács, E.; Wojnárovits, L. Radiolysis of paracetamol in dilute aqueous solution. Radiation Physics and Chemistry 2012, 81, [IF: 1,375] Független idéző: 6. Sági, Gy.; Csay, T.; Szabó, L.; Pátzay, Gy.; Csonka, E.; Takács, E.; Wojnárovits, L. Analytical approaches to the OH radical induced degradation of sulfonamide antibiotics in dilute aqueous solutions. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2015, 106, [IF: 3,169] Független idéző: 4. Könyvfejezet: Wojnárovits, L.; Takács, E.; Szabó, L. Gamma-ray and electron beam-based AOPs. In Advanced Oxidation Processes for Water Treatment: Fundamentals and Applications; Stefan, M. I., Ed.; IWA Publishing, Nyomdában. 25

30 Köszönetnyilvánítás Dr. Tóth Tünde Prof. Takács Erzsébet Prof. Wojnárovits László Prof. Mohácsiné Farkas Csilla Dr. Engelhardt Tekla Rácz Gergely Papp Zoltán Takács László Sugárkémiai Laboratórium összes munkatársa Család Barátok 26

31 Köszönöm megtisztelő figyelmüket!
27