Disszekciós eljárások

Az előadások a következő témára: "Disszekciós eljárások"— Előadás másolata:

1 Disszekciós eljárások
Szövet-szeletek Explantátum - biopszia Megőrzött szövet-struktúra (legalább a kiültetés pillanatában) 3. Kézi mikrodisszekció Biopszia

2 LCM=laser captured microdissection
friss fagyasztott szöveten alkalmas szelektív sejt-izolálásra; molekuláris összetevők elemzésére Leica Kritikus tényezők: jól választott szövetrész, kivágott szövet „elkapásának” módszere, molekuláris integritás megőrzése

3 Sluka , et al., Progress in Histochemistry and Cytochemistry;2008

4 Szövet-disszociáltatás: szövetből sejtszuszpenzió
Módszer kiválasztása szövet típus – ECM aránya; állaga; - Sejtkapcsolatok típusa, aránya, erőssége szövet kora kinyerendő sejttípus I. Mechanikus szövet-disszociáltatás Csak laza – pl. Lép vagy korai embrionális – szövetek esetén 1. A szerv aprítása (~ mm-es darabkák) fiziológiás oldatban 2. Triturálás (szűk [ um] kapilláris-nyíláson át; Emelt viszkozitású (szérum; BSA) fiziológiás oldatban 3. Szűrés (40 – 120 um pórusméretű háló) vagy elkülönítő centrifugálás (sejtek csapadékba ülepíthetők 200 – 400 g; 10 min)

5 Törmelék összetapadását gátolja
II. Enzimatikus disszociáltatás Ca2+ gátolja Ca2+ szükséges Törmelék összetapadását gátolja Worthington;

6 Szilárd szövetek disszociáltatása sejtekre - példák

7 Sejtszámlálás Sejtszámláló kamra Áramlásos sejtszámoló berendezések

8 Szövetből nyert „primér” sejtszuszpenziók: heretogén sejt-preparátumok
Embrionális szövetek: gyors agregáció! E19 patkány kisagyból nyert sejtszuszpenzió Egér lép dendritikus sejtek

9 fizikai- kémiai paraméterek alapján biospecifikus sajátságok alapján
Sejtszeparálás fizikai- kémiai paraméterek alapján biospecifikus sajátságok alapján - szűrés - ülepítés - differenciál-centrifugálás - sűrűség-gradiens centrifugálás - elutriáció - áramlási citometria (FACS) - szelektív sejtadhézión alapuló sejtszeparálás: - sejt affinitás kromatográfia, - panning - mágneses elválasztás - sejtszeparálás szelektív lízissel - sejtszeparálás szelektív előnyök biztosításával

10 minta ~ Sejtszeparálás fizikai- kémiai paraméterek alapján
szeparálás méret és alak alapján szeparálás sűrűség alapján Szedimentációs sűrűség-gradiens centrifugálás Egyensúlyi sűrűség-gradiens centrifugálás pl vérsejt izolálás minta oldat-rétegek sűrűsége ~ részecskék sűrűsége a részecskék sűrűsége nagyobb, mint az oldat-rétegeké emlős sejtek fajsúlya ~ 1,06 g/cm3 Idő!! ha túl sokáig centrifugálunk, minden a csapadékba kerül! részecke a rá jellemző sűrűségtartományban marad

11 mononukleáris sejtek polimorfonukleáris sejtek (granulociták) vvt

12 Centrifugal Elutriation (CE)
Centrifugal elutriation: Sedimentation takes place in the presence of field flow. CE is also called counterstreaming centrifugation; counterflow centrifugation ; counterflow centrifugal elutriation (CCE)

13 Mágneses sejt szeparálás

14 Fluorescence Aided Cell Sorter - FACS

15 Side population: Hoechst 33342 efflux (ABCG2)
Primitív (pluripotens) őssejtet azonosítja Side population: Hoechst efflux (ABCG2)

16 BD FACS Vantage SE BD FACSort