laboratóriumi diagnosztikája

Az előadások a következő témára: "laboratóriumi diagnosztikája"— Előadás másolata:

1 laboratóriumi diagnosztikája
Honvédkórház Az IBD és a coeliakia laboratóriumi diagnosztikája Miklós Katalin Honvédkórház- ÁEK KLDO Klinikai Immunológia Mediconsult

2 Ideális labordiagnosztikai marker: - könnyen, gyorsan kivitelezhető
költséghatékony reprodukálható betegség specifikus informatív a betegség aktivitására alkalmas a kezelés hatékonyságának követésére prognosztikai jelentőséggel bír IBD-ben a laboratóriumi markerek csak kiegészítők, nincs „gold standard” a klinikai történések, tünetek, a fizikai vizsgálatok, a radiológia, endoszkópia, hisztológia és szerológia együttes eredményei jellemezhetik a betegség súlyosságát, ill. bírhatnak prognosztikai jelentőséggel.

3 Akut fázis fehérjék (gyulladásos markerek):
Fertőzés, gyulladás, nekrózis, neoplasia, trauma, stress, Eltérő időtartamok múlva koncentrációjuk visszatér a normális tartományba, C reaktív protein (CRP) süllyedés fehérvérsejt és trombocita szám albumin α1 glycoprotein (orosomucoid) hősokk proteinek IBD-ben is akut fázis reakció leukocita migráció a bélbe, (IL-6, TNFα, IL-8) fehérjetermelés termékei kimutatható a szérumban ill. a székletben

4 C reaktív protein (CRP)
korai marker féléletidő: 19 óra Májban termelődik < 1mg/l Komplement aktiváción keresztül fejti ki hatását, szerepet játszik az opszonizációban, sejtpusztításban Mérsékelt gyulladásban, vírusfertőzésben mg/l Aktív gyulladásban, bakteriális fertőzésben: mg/l > mg/l égés, Akut fázisban mg/l-t is elérheti IBD-ben a gyulladásos markerek közül a legjobb: diagnózis, differenciál diagnózis, aktivitás, követés, prediktív érték elsősorban CD-ben UC-ben kevésbé (nincs egzakt magyarázat)

5 Süllyedés: CRP-hez képest lassabban emelkedik, napok alatt tér vissza a normál tartományban Fehérvérsejt szám: Emelkedik, nem specifikus, kezelés is befolyásolja Albumin: Negatív akut fázis fehérje, nem specifikus Egyéb akut fázis fehérjék: pl α1 glycoprotein (orosomucoid), fibrinogén, lactoferrin Β2 mikroglobulin, szérum amyloid A, α2 globulin, α1 antitripszin IBD rutinban nem használatosak, ellentmondó eredmények, Markerek székletben: Jól reprezentálják a bél nyálkahártya gyulladását (IBD-ben endoszkópia kiváltása?) lactoferrin, lizozim, elasztáz, mieloperoxidáz, calprotectin

6 Immunszerológia lehetőségei:
Olyan antitest vagy paraméter, amely ebben a betegcsoportban: » diagnosztikus értékű » aktivitási marker » prognosztikai jelentőségű » pathogenetikai szerepet játszik NINCS I. Autoantitestek II. Mikrobiális antigén ellenes antitestek III. Egyéb » Komplement fehérje szérumszintek (C3, C4) » hősokk proteinek » TNF-α terápiás válasz követésére » rezisztin: fehér zsírszövet terméke, ciszteinben gazdag új ígéretes biomarker IBD-ben? aktivitás jelző? » IgG típusú étel allergia/ intolerancia / diéta » YKL-40 új, specifikus marker szérumban és szinoviális folyadékban egyaránt, humán cartilage glycoprotein

7 I. Autoantitestek IBD-ben
pANCA (perinukleáris anti-neutrophil citoplazmatikus antitest) PAb (anti-exokrin pancreas antitest) GAb (bél-kehelysejt ellenes antitest)

8 ANCA IFA gyulladásos bélbetegségekben
atípusos p-ANCA, pANCA szerű rajzolat, de pl. a granulociták lebenyei megnagyobbodottnak látszanak szubsztrát: ethanol fixált humán granulocita MPO negatív

9 Atípusos pANCA mintázatot adó egyéb autoantitestek
anti-dsDNA anti-SS-A /Ro anti-lamin anti-Golgi SMA autoimmun májbetegségben atípusos ANCA 50-80%

10 ANCA pozitivitás klinikai jelentősége IBD-ben
A pANCA pozitív IBD-s betegek kevésbé reagálnak bizonyos terápiákra terápia megválasztása szempontjából is fontos az ANCA +/- ANCA titer meghatározás szükséges sebészi beavatkozás magas ANCA titernél nagyobb %-ban Pozitív esetek agresszívabb kezelést igényelnek Szerológiailag negatív esetekben kevesebb komplikáció ANCA kiegészítő teszt: ANCA combi ELISA: laktoferrin elasztáz lizozim katepszin G BPI

11 ANCA pozitivitás klinikai jelentősége
Betegség ANCA mintázat ANCA antigén Colitis ulcerosa 60-80 % atípusos p laktoferrin, katepszinG M. Crohn 20% atípusos p ismeretlen Cysticus fibrosis 90% pANCA BPI RA 30% pANCA, GS-ANA ismeretlen, ANA Felty szindróma 50-60% p SLE 15-30% pANCA, GS-ANA elasztáz, laktoferrin, (MPO) CAH 80% atípusos p PSC 65% pANCA PBC 5% atípusos pANCA

12 Pancreas ellenes (PAb) antitest Crohn`s specifikus
Kimutatás: ELISA és IFA technika, IgG és IgA ELISA antigén: GP2 78 kDa glikozilált fehérje, N-terminális végén karbohidrát csoport pancreas acinus sejtek zimogén granulumaiban, membránhoz kötött glycoprotein, konformációs epitóp azonos(?) I-es típusú diabetes antigénnel - humán gyulladásos colon biopsia mintából is kimutatták, ezért CD-ben pathofiziológiai szerepe felmerül pancreas

13 Pancreas ellenes (PAb) antitest
CD-ben a szenzitivitása viszonylag alacsony (20-30%) ugyanakkor PPV 93% GP2 IgG pozitivitás jól korrelál ASCA IgG-vel CD + extraintestinális szövődményként idiopátiás krónikus pancreatitis 68% 46% kínai, 22% kaukázusi CD-s betegekben 2-6% UC-ben 0-2% normál kontrollokban Infliximab kezelés nincs hatással az ellenanyag titerére

14 Intestinal goblet cell antitest (GAb) Kehelysejt ellenes antitest
Kehely sejtek: mucin szekretáló intestinális sejtek Szerepük a mucosa felszínének védelme a bakteriális fertőzésekre adott gyulladásos válasz szabályozásában van IBD-ben a számuk csökkent Antitestnek szerepet tulajdonítanak az IBD pathogenezisében Antigén nem ismert IBD-s betegek hozzátartozóiban pozitivitása a betegség kifejlődésére fogékonyságot jelez UC-ben 28%

15 II. Mikrobiális antigén ellenes antitestek újabb lehetőségek az IBD szerodiagnosztikájában
mikroorganizmusok cukor (glikán) antigénjei - baktériumok, gombák sejtfalának és tokjának építőelemei Glikánok/polisaccharidok: szénhidrát komplexek, melyek fehérjékhez, zsírokhoz, sejtekhez (baktérium) kötődnek Vizsgálatuk információt adhat a sejten belüli ill. sejtek közötti folyamatok megértéséhez A glikánok és a baktériumsejt közötti kölcsönhatások megértése fontos a bakteriális diagnosztika számára A sejtben zajló glikán-függő folyamatok megismerése a jelátvitel, a toxikus útvonalak megértését segíti és Új biomarkerek bevezetését teszi lehetővé

16 Cukor-antigének Crohn`s diagnosztikában
ASCA/ IgA, IgG (anti–Saccharomyces cerevisiae antitest) gASCA IgG (kovalensen kötött mannóz) ACCA IgA anti-chitobioside carbohydrate antitest ALCA IgG anti-laminaribioside carbohydrate antitest AMCA IgG anti-mannobioside carbohydrate antitest Anti-OmpC (anti-Escherischia coli külső membrán porin antitest) Anti I2 IgA Pseudomonas fluorescens DNS fragment antitest Anti CBir1 IgG flagellin antitest „mix”: különböző baktérium ellenes antitestek

17 Mikrobiális antigén ellenes antitestek kimutatásán alapuló szerológiai tesztek
ASCA - anti–Saccharomyces cerevisiae antitest - IgG és IgA - antigén: élesztőgomba sejtfal 200 kDa-os mannóz tartalmú szekvenciája (más mikroorganizmusokban is) - kimutatás: ELISA, IFA, Glycochip S. cerevisiae, pékélesztő mannóz

18 anti–Saccharomyces cerevisiae antitest (ASCA)
ELISA antigén a tesztekben: korlátozott információ: „részben tisztított és darabolt S. cerevisiae ag”, ASCA IgA vagy ASCA IgG esetén PPV 77-88% kombinációban >90% a specificitás teszt szenz.% spec. % PPV NPV 1.ELISA 53 97 95 68 2. 46 94 66 3. 50 4. 30 98 59 IIF 51 IFA Klebl Int J Colorect Dis 2004;19: Vermeire S Inflamm Bowel Dis 2001;7:8-15.

19 ASCA - Glycochip technika: affinitás assay
- microarray - a chip felületére glikánokat rögzítettek: - kimutatás ACCA IgA és ALCA IgG antitestekkel együtt - inkubáció a szérummal Kötődési profil 33 glikánhoz A kötődött antitestek mennyiségének meghatározása biotinált anti-humán IgG-vel

20 ANCA / ASCA pozitivitás diagnosztikus értéke gyulladásos bélbetegségekben
szenz.% UC spec.% CD PPV % pANCA + 65 - 15 ASCA + 12 61 pANCA +/ ASCA - 57 97 92.5 pANCA -/ 49 96

21 Kombinált fluoreszcens teszt
kehelysejt ANCA pancreas ASCA Colitis ulcerosa Crohn′s betegség 83 % 76 % 80 % 67 % 39 % 28% GAb pANCA GAb+pANCA PAb ASCA PAb+ASCA

22 Kombinált cukor-antigén ELISA Crohn`s diagnosztikában
GlycoChip ELISA ACCA IgA 5.6% ALCA IgG 2.4% 0.8% szenzitivitás: 77,4% specificitás: 90,6% 7.3% 8.9% 12.1% anti-szénhidrát antitestek IgA anti-chitobioside carbohydrate (ACCA) IgG anti-laminaribioside carbohydrate (ALCA) IgG anti-kovalensen kötött mannóz (gASCA) gASCA IgG 40.3% CD vs. UC Szenz% Spec. % 1 teszt pozitív ACCA, ALCA v. gASCA 77,4 90,6 min. 2 teszt pozitív 26,6 99,1 minden negatív 22.6%

23 Anti-OmpC antigén: E. coli adhéziós fehérje
anti-Escherischia coli külső C membrán porin antitest főleg CD-ben fordul elő, de szenzitivitása alacsony 24-55% CD (gyerekekben alacsonyabb) 5-11% UC 5% álpozitív pozitív betegekben gyakoribb a lokalizáció progressziója hosszabb betegségfennállás után is gyakoribb korai sebészeti beavatkozás igénye alacsonyabb ha negatív? az ASCA negatív Crohn beteg diagnosztikájában lehet nagyobb szerepe (forrástól függően:5-15%-tól 46%-ig) teljes CD populáció 21%

24 Anti-OmpC tesztek ELISA, IgA OmpPlus teszt
antigének: Crohn betegekből származó 2 (?!) baktérium törzsből izolált külső membrán proteinek (outer membrane proteins) Jobb találati arány, mint az 1 antigént használó tesztek - ASCA, pANCA, OmpC kombinációban a teljes Crohn populáció %-a diagnosztizálható OmpC 16% ASCA 15% 30% negatív 16% összesen: 84% 4% 6% 5% 8% pANCA

25 Anti-I2: Pseudomonas fluorescens DNS fragment antitest
- tetR bakteriális transzkripciós családdal homológ - IgA, ELISA teszt - előfordulása Crohn betegségben : % (William J.et al ) colitis ulcerosában : 10 % (Papp M. et al ) OmpC+ 55% ASCA+ 56% ASCA 12% 9% OmpC 7% 26% negatív pANCA+ 23% 9% 13% I2+ 50% I2 2% összesen: 78% 22%

26 Anti CBir1 IgG flagellin antitest
- atípusos pANCA pozitív Crohn`s betegekben 40-44%-ban CU-ban 4%-ban pozitív (Papp M. et al ) - differenciál diagnosztikában segítség

27 IgG válasz a rectalis mucosa-ból izolált fiziológiás baktériumok ellen
Peptostreptococcus anaerobius Bacteroides fragilis Enterococcus faecalis Clostridium clostridioforme Bifidobacterium adolescentis Bif angulatum Lactobacillus paracasei Escherichia coli

28 Új fejlesztés kombinált fluoreszcens teszt
CUZD1 + GP2 Proteoglycans CUB/zona pellucida-like domain containing protein1 Pancreatic zymogen granule membrane major glycoprotein EUROIMMUN

29 Új cukor-antigén tesztek interpretációs lehetősége
Negatív 1. szint 2. szint 3. szint 4. szint Pozitív gASCA EU<20 25>EU>20 40>EU>25 60>EU>40 110>EU>90 EU>120 ALCA 75>EU>60 EU>75 ACCA EU<50 65>EU>50 95>EU>65 110>EU>95 150>EU>110 EU>150 AMCA 60>EU>50 90>EU>60 135>EU>110 EU>135 score 0,25 0,34 0,45 0,9 1 A kombinált score < 1 – IBD negatív A kombinált score ≥ 1 – IBD pozitív, specificitás legalább 85 % A kombinált score ≥ 1,7 – IBD pozitív, specificitás legalább 95 % Előfordulhat, hogy a külön-külön negatív tesztek az összesített adatok alapján pozitív értéket adnak

30 Calprotectin kimutatása székletből
Gold-standard? Krónikus gyulladásos bélbetegségek korai markere Költség hatékony, könnyen kivitelezhető vizsgálat (ELISA) Calprotectin: 36 kDa kálcium és cink kötő fehérje, Aktivált granulocitákból szabadul fel a bélben a belekben zajló gyulladás markere, stabil, nem degradál Megjelenése a székletben direkt bizonyítéka a granulociták bélbe történő migrációjának Szintje korrelál a béllumenben lévő granulocita számmal Diagnosztikai, differenciál diagnosztikai jelentőség IBD-ben Jól korrelál az endoszkópos eredményekkel (sőt), szövettannal

31 Calprotectin kimutatása székletből
Szenzitivitás: 89%, Specificitás: 79% Magas pozitív/negatív prediktív értékű, relapust jelzi Segítségével differenciálni lehet a funkcionális és organikus hasmenés között (IBS-ben nincs) Aktivitás követésére alkalmas, megkönnyíti a gyógyszeradagolás beállítását, a relapsus elkerülését Emelkedett: bélfertőzések (felülfertőzés, vagy relapsus?) proliferáló béldaganat polyp

32 Diagnosztikus dilemmák esetére ajánlott egyéb immunszerológiai tesztek
Anti-nukleáris antitest (ANA) Szisztémás autoimmun kórképek gasztrointestinális szövődménnyel SLE, Sjögren, scleroderma, vasculitis: hányinger, hasmenés, máj-epe érintettség, nyálkahártya fibrózis, malabsorpcio, reflux betegség teleangiectasia: bélrendszeri vérzések vékony-vastagbél dismotilitás amiloidosis Immunglobulin szintek : IgA hiányban gyakori hasmenés Hasonló tünetegyüttest adó kórképek: gastritis, anaemia perniciosa, coeliakia coeliakia specifikus antitestek: EMA, tTG IgG antitestek izolált pozitivitása bélbetegségekben 5-10 %

33 HLA molekula DQ2 vagy DQ8 helyi gyulladás AGA tTG; EMA; ARA
búza + rozs + árpa glutén, α-gliadin mucosa-ban transzglutamináz expresszió gliadin + tTG glutamin – glutaminsav deamidálás gliadin peptid + dendritikus sejtek HLA molekula DQ2 vagy DQ8 CD4+ T sejt aktiváció helyi gyulladás T-sejt függő gliadin válasz autotolerancia áttörése citokin termelés helyi B-sejt aktiváció gliadin specifikus antitest termelés perifériás B-limfociták specifikus antitest termelése AGA tTG; EMA; ARA

34 Diagnosztika eszköztára coeliakiában
Endoszkópos beavatkozás biopsia szövettan Marsh 0-3 boholyatrophia Genetikai vizsgálat HLA DR DQ Szerológiai vizsgálat autoantitest szűrés IgA és/vagy IgG Európai Gyermekgasztroenterológus Társaság kritériumrendszere gluténterhelés 1970 három 1990 kettő

35 Endoszkópia Glutén toxicitás következményei:
Bélbolyhok elsorvadása a vékonybélben Kripta sejtek megnyúlnak, megnagyobbodnak, mitotikus aktivitásuk megnő Gyulladásos epithelsejtek felszaporodnak, pusztulnak Intraepithelialis lymphocyta szám megnő doudenum mozaikszerű rajzolat normál coeliakiás kezeletlen coeliakiás

36 Genetikai háttér coeliakiás betegek 95%-ban: HLA-DR3-DQ2 haplotípus
DQA1*0501, DQB1*0201 allél (6. kromoszóma rövid karján) coeliakiás betegek 5%-ban: HLA-DR4-DQ8 haplotípus DQA1*0301, DQB1*0302 allél Rutin diagnosztikában nem alkalmazzuk, családvizsgálatban, látens coeliakiában döntő tényező lehet

37 Felszívódási zavar laboratóriumi eltérései
csökkent összfehérje (transferrin, albumin, prealbumin) csökkent elektrolit szint: Na, K alacsony összkoleszterin, HDL, LDL-koleszterin, csökkent Ca, P, (ionizált Ca) csökkent nyomelem-szint: Zn, Mg, Cu csökkent vitaminszintek: A, B, C, D, K csökkent vas, fólsav alacsony prothrombin szint csökkent lipáz szint csökkent epesav szint emelkedett alkalikus foszfatáz (AP,csont izoenzim) emelkedett transzaminázok normál lelet

38 Vérkép eltérések ۰csökkent (vashiány) vashiány: szérum vas alacsony
ferritin alacsony transferrin alacsony vaskötőkapacitás magas szaturáció alacsony anemia előfordulása: 95% hgb↓, hkt↓, vvt szám↓, MCH ↓↑, MCHC ↓ MCV: ۰csökkent (vashiány) ۰ emelkedett (B12 és/vagy fólsav hiány) ۰ normális (a kettő kombinációja) RDW növekedés: thrombocytosis leukocytosis, leukopenia RDW növekedés >13% jellemző, mert többféle méretű vvt populáció egyidejűleg van jelen

39 Immunszerológiai vizsgálatok
Szükséges minta natív vérsavó Immunglobulinok kvantitatív meghatározása (IgA hiány!) Komplement fehérjék szérumszintje (CH50, C3, C4) Specifikus autoantitest vizsgálatok Szerológiai tesztek helye a klinikumban: diagnózis felállítása ill. differenciáldiagnózis atípusos coeliakiák korai felismerése rejtett kórkép felismerése (LKS) coeliakiához nagy gyakorisággal társuló betegségekben szenvedők szűrése felesleges biopsiák elkerülése diéta ellenőrzése diétázó panaszosok ellenőrzése családszűrés

40 specifikus autoantitestek kimutatása (célantigén a szöveti transzglutamináz)
Indirekt immunfluoreszcencia retikulin IgA vagy IgG endomysium (EMA) IgA vagy IgG Enzim jelzéses módszer (ELISA) anti-gliadin (AGA) anti-deamidált gliadin (DGP) anti-transzglutamináz (tTG) IgA és IgG anti-F-aktin

41 Anti-gliadin antitest (1958)
Kisdedkórban kimutatása jelentős lehet (fél-1 év között) Anti-gliadin antitest (1958) Elsőként felismert és coeliakia szűrésére bevezetett antitest kimutatása kvantitatív (ELISA) Alkalmas az aktivitás követésére, a diéta ellenőrzésére Szenzitív, de specificitása alacsony, Gliadin IgG emelkedett lehet más, főleg bélnyálkahártya gyulladásával járó betegségben (Crohn`s), irritábilis colon sy., tehéntej intoleranciában, táplálék allergiákban, parazitás fertőzés, cisztikus fibrózis, de egészségesekben is kimutatható Izolált pozitivitása gyakran felesleges invazív beavatkozásra ad okot Nem alkalmazható diagnózis felállítására családtagok, populációk szűrésekor, atípusos coeliakiák szerológiai vizsgálatakor

42 Endomysium specifikus antitest (1978)
Kimutatása indirekt immunfluoreszcencia, szubsztrát: majom nyelőcső, vagy humán köldökzsinór Szenzitivitása, specificitása magas Antigén a szöveti transzglutamináz Diagnózis felállítására, aktivitás követésére, diéta ellenőrzésére egyaránt alkalmas Szisztémás szövődmény autoantitestjei zavarhatják a kiértékelést, gyakorlat szükséges, munkaigényes Kisdedkórban negatív lehet

43 Anti-retikulin antitest (ARA)
Kimutatása: indirekt immunfluoreszcencia, szubsztrát: rágcsáló vese, máj, gyomor (LKS) szövet Vizsgálata kevésbé elterjedt Szenzitivitása, specificitása magas Antigén a szöveti transzglutamináz 4 típus, klinikailag az R1 jelentős Nem várt pozitív minták felismerése (IgG típus)

44 Szöveti transzglutamináz antitest, tTG (1997)
Ca dependens, keresztkötő enzim (glutamin-lizin) Feladata az extracelluláris mátrix stabilitásának biztosítása sebgyógyuláskor Kimutatása ELISA Kvantitatív Szenzitivitása, specificitása magas Alkalmas az aktivitás követésére, a diéta ellenőrzésére Az antigén 3 dimenziós konformációs epitópjai sérülhetnek, álnegatív, álpozitív lehet Álpozitív eredményt írtak le pl. I-es típusú diabates-ben, autoimmun hepatitiszben

45 Új ELISA tesztek a coeliakia diagnosztikában
☺deamidált gliadin peptid (glutamin glutamin sav) kombinált ELISA, különböző gyártók saját fejlesztésű kitek specificitása jobb a natívnál h-tTG/DGP IgA/IgG screen (konfirmálás szükséges)

46 ☺ anti-F-aktin IgA ELISA
szenzitiv markere az intestinális mucosa károsodásnak mennyisége korrelál a bélboholy károsodás mértékével - ellaposodott nyálkahártya 98,2 % - szubtotál bélboholy atrófia 89.0 % - részleges bélboholy atrófia 30.0 % szerológiai endoszkóp (?) alkalmas a diéta monitorozására szenzitivitás 80% specificitás 85% EMA, tTG negativitás mellett is lehet pozitív (?) F-aktin IgG: autoimmun hepatitisz % primer billiaris cirrhosis 22% egészségesek 3-18%

47 Autoantitestek szenzitivitása és specificitása coeliakiában
AGA IgA EMA IgA tTG IgA 52 – 100 86 – 100 71 – 100 90 – 100 AGA IgG EMA IgG tTG IgG 57 / 100 - 47 – 94 IgA + IgG AGA IgA + IgG tTG IgA AGA + IgA EMA 83 – 100 98.5 100 71 – 99 73 AESKU Science, no.2,oktober 2005 kombinált ELISA htTG IgG/IgA + DGP IgA/IgG szenzitivitás : 100% specificitás: 98 %

48 Rutinszerűen IgA tTG-ra történő szűrés helyett, kevert konjugátum
(IgA/IgG) ELISA teszt ☺IgA szint mérés kiváltása ☺csökkent IgA szint mellett biztosabb diagnózis ☺normál IgA szint mellett is előfordul csak IgG típusú coeliakia tTG IgA / IgG screen ELISA teszt htTG IgG/IgA + DGP IgA/IgG screen ELISA coeliakia szűrésre jól alkalmazhatók Kombinált metodika: tTG IgA/IgG screen ELISA és EMA IFA párhuzamos vizsgálata javasolt, magas titerű egybehangzó pozitivitásuk diagnosztikai jelentőségű, nem szükséges a biopsia diagnosztikus kritériumok átgondolása időszerű!

49 Coeliakia antitest-diagnosztikai algoritmusa
coeliakia gyanú S Z Ű R Ő T E S Z T EMA IgA pozitív tTG IgA pozitív EMA negatív tTG IgG pozitív EMA IgA tTG IgA / IgG IgA hiányos CD felmerül EMA negatív tTG IgA/G negatív Szerológiailag igazolt coeliakia CD nem valószínű EMA IgG negatív pozitív

50 Köszönöm a figyelmet!