Világveszedelem No.1 1. Moratórium a genetikai manipulációkra - Asilomar: a feloldozás Moratórium a genetikai manipulációkra - Asilomar: a feloldozás.

Az előadások a következő témára: "Világveszedelem No.1 1. Moratórium a genetikai manipulációkra - Asilomar: a feloldozás Moratórium a genetikai manipulációkra - Asilomar: a feloldozás."— Előadás másolata:

1

2

3 Világveszedelem No.1 1.

4 Moratórium a genetikai manipulációkra - Asilomar: a feloldozás Moratórium a genetikai manipulációkra - Asilomar: a feloldozás ◊ Önkéntes moratórium ◊ Közvetlen ok: a teljes SV40 vírus genom klónozása E. coli-ban: fertőző tumor? Aggodalom: az emberi egészségért és a földi ökoszisztémáért ◊ Asilomari Konferencia (1975): Valami akkor veszélyes, ha annak is bizonyul ◊ Önkéntes moratórium ◊ Közvetlen ok: a teljes SV40 vírus genom klónozása E. coli-ban: fertőző tumor? Aggodalom: az emberi egészségért és a földi ökoszisztémáért ◊ Asilomari Konferencia (1975): Valami akkor veszélyes, ha annak is bizonyul Paul Berg James Watson Sidney Brenner Paul Berg James Watson Sidney Brenner 2.

5 1. Általunk alkotott fertőző betegségek rászabadítása az emberiségre - AIDS: poliomielitis (járványos gyermekbénulás) vakcinából? 2. Megváltoztatjuk az emberi evolúciót 3. Beavatkozunk a Teremtő munkájába 4. Egészségtelenek a genetikailag módosított táplálék növények és állatok 5. Megváltoztatjuk az ökoszisztémát 3.

6 4.

7 plazmid vektor transzgén Illegitim rekombináció - véletlenszerű DNS beépülés Illegitim rekombináció - véletlenszerű DNS beépülés transzgén 5.

8 idegen DNS cél szekvencia határoló sz. transzfer vektor kromoszóma Knock-inKnock-out genetikailag módosított szekvencia 6.

9 Tenyésztett sejttípusok 1.Primér sejttenyészet 2.Tumoros sejttenyészet 3.Halhatatlan sejtvonalak 1.Primér sejttenyészet 2.Tumoros sejttenyészet 3.Halhatatlan sejtvonalak 7.

10 Transzfekció 1. Liposzóma 2. CaPO 4 3. Elektroporáció 4. Génpuska Vírus vektor 1. Retrovírus 2. Adenovírus 3. Adeno-asszociált vírus Transzfekció 1. Liposzóma 2. CaPO 4 3. Elektroporáció 4. Génpuska Vírus vektor 1. Retrovírus 2. Adenovírus 3. Adeno-asszociált vírus Génbevitel – tenyésztett sejtekbe DNS Védő réteg Homing peptidek Vízben oldódó drog Kristályos drog Lipid kettősréteg LIPOSZÓMA 8.

11 Liposzóma Elektroporáció Retrovírus Génbeviteli módszerek lipid oldat DNS összekeverés DNS a liposzómában sejtekhez adjuk a liposzóma sejthez tapad liposzóma fúzió a sejt- membránnal DNS a sejtmagban idegen gén kifejeződése sejtkultúra idegen gén szelekciós marker összekeverés elektromos impulzus a sejt felveszi a DNS-t DNS a sejtmagban stabil tranziens expresszió Szelekció + - expressziós vektorok pakoló sejtvonalakhoz nem-esszenciális gének eltávolítása transzformáns sejtvonalak Idegen gén klónozása a vírusba vírus izolálás becsomagolódás Vektor RNS célsejtek fertőzése idegen gén expressziója RNS dsz-DNS integrálódás a genomba idegen gén kifejeződése

12 Idegen gén sejtekbe való bevitele (transzgén) Idegen gén sejtekbe való bevitele (transzgén) transzfekció 9.

13 Idegen gén - átmeneti kifejeződés 10.

14 Idegen gén - átmeneti kifejeződés 10.

15 Idegen gén - stabil kifejeződés 11.

16 Idegen gén - stabil kifejeződés 11.

17 Idegen gén bevitele Adeno-asszociált vírus vektorral AAV: parvovírus 12. AAV vektor 48 óra transzfekció AAV helper AAV DNS rekombináns AAV rekombináns AAV

18 1.Mikroorganizmusok 2.Növények 3.Állatok 4.Ember 1.Mikroorganizmusok 2.Növények 3.Állatok 4.Ember Genetikailag Módosított Szervezetek (GMO-k) Genetikailag Módosított Szervezetek (GMO-k) 1.Alapkutatás 2.Gazdasági haszon 1.Alapkutatás 2.Gazdasági haszon GMO: G enetically M odified O rganism Definíció: új genetikai anyag hozzáadása egy egyed genomjához 13. FELHASZNÁLÁS TAXONÓMIA

19 Mik ezek? - olyan állatok vagy növények, melyek DNS-ébe egy vagy több idegen gént ültettünk be Mire jók? - (1) a génfunkció tanulmányozása; (2) gazdaságilag fontos GMO-k; (3) jövőben: génterápia Transzgénikus élőlények 14.

20 Csiravonal génbevitel  idegen gén minden sejtben jelen van 1. DNS mikroinjekció 1. DNS mikroinjekció  zigóta 2. Embrionális őssejtekbe való génbevitel 3. Vírus vektorok (retrovírusok)  zigóta Szomatikus génbevitel  idegen gén NEM minden sejtben van jelen 1. Fizikai/kémiai 2. Vírus vektorok 3. Őssejtekbe Génbevitel élő egyedekbe Közvetlen: in vivo Sejt által közvetített: ex vivo 15.

21 + Pronukleáris mikroinjekció promóter idegen gén idegen gén, promóterrel pronukleáris injekció Az injektált embriók beültetése álterhes nőstényekbe transzgénikus alapító transzgénikus utód plazmid Idegen gén bevitele zigótába pronukleáris inokulációval 16.

22 Az idegen gén injektálása a hím pro-nukleuszba Az injektált zigóták beültetése nevelő anyákba Az utódok kb. 10 - 30%-a tartalmaz idegen DNS-t. Az idegen DNS-t kifejező egerek tenyésztése Pro-nukleuszok Idegen gén bevitele zigótába pro-nukleáris inokulációval 16. +

23 Idegen gén bevitele retrovírus vektorral 17.

24 Blasztula ( hólyagcsíra ) Blasztula ( hólyagcsíra ) Belső sejttömeg ES sejtek Idegen gén bevitele - embrionális őssejtekbe Idegen gén bevitele - embrionális őssejtekbe 18.

25 x x x x Donor szülők-1 Donor szülők-2 Belső sejttömeg Hólyag csíra ES sejt tenyészet Klónozott gén ES sejt és idegen gén összekeverés Transzgént tartalmazó sejtek szelekciója Mikroinjekció Transzgénikus ES sejt beépül az embrióba Embrió méhbe ültetése Kiméra egerek Kiméra Normál Heterozigóta transzgénikus egerek Heterozigóta transzgénikus Homozigóta normál Homozigóta transzgénikus antibiotikum rezisztencia gén 2. 3. 4. 6. 5. 1. 7. 8. 9. 10. 11. ES sejtekbe való génbevitel ES sejtekbe való génbevitel Befogadó szülő 19.

26 Csipke Rózsika és Béka Herceg Sleeping Beauty & Frog Prince transzgén IR transzpozáz promóter Bináris rendszer Megjavított hal ill. béka DNS transzpozon Izsvák Zsuzsanna Ivics Zoltán X.

27 A. Transzgén expresszió A. Transzgén expresszió (funkció nyerés) Gén inaktiváció B. Gén inaktiváció (funkció vesztés) a. “Mindenütt” expresszió b. Szövet-specifikus expresszió c. Sejt-specifikus expresszió UPUP transzgén PNP transzgén TSP transzgén IPIP 1.Knock-out technológia 2.RNS interferencia (knock-down) 1. Konstitutív (folytonos) 2. Indukálható A génkifejeződés szabályozása 20.

28 Eredeti gén (exon + intron) BAC - technológia Szabályozó elemek Idegen gén 100,000- 400,000 bp BAC Genomiális DNS RE emésztés Rekombináns BAC Transzformáció Ligálás Szelekció Mikroinjekció Transzgénikus egér Sejt-specifikus génexpresszió 21.

29 2007 Knock-out állatok M. Evans: őssejt technológia kidolgozása (őssejteket használnak az alábbi technikákhoz) M. Capecchi & O. Smithies : homológ rekombináció: - knock-out technológia - defektes gének kicserélése működőképesekre fontosság a gyógyításban 22. Kutatási paradigma: a kiütött gén funkciója a kapott fenotípus fordítottja

30 Knock-out állatok előállítása határoló sz. Genomiális DNS neo tk Genomi DNS neo „Targeting” plazmid konstrukció Genomi DNS neotk Homológ rekombináció Illegitim rekombináció Szedercsíra Zigóta Hólyagcsíra Belső sejttömeg ES sejtek 23.

31 x x x x Donor szülők-1Donor szülők-2 ICM ES sejt tenyészet Targeting szekvencia ES sejt és idegen gén összekeverés Transzgént tartalmazó sejtek szelekciója Mikroinjekció Transzgénikus ES sejt beépül az embrióba Embrió méhbe ültetése Kiméra egerek KiméraNormál Heterozigóta egerek HeterozigótaHomozigóta normál Homozigóta knockout 2. 3. 4. 6. 5. 1. 7. 8. 9. 10. 11. tkneo  Hólyag csíra ES sejtekben való génkiütés Befogadó szülő 24.

32 In vivo RNS interferencia Mire jó az RNSi? (1) génfunkció tanulmányozása (2) terápiás cél: (a) hibás gén működésének blokkolása (b) tumorokban a túlműködő protoonkogének csillapítása Intraperitoneális Intradermális intramuszkuláris Intranazális Intracerebrális Intravaszkuláris perfúzió, Hipodermális injekció Mit viszünk be? Hová visszük? (1) Hosszú dszRNS ---- (nem használható emlősökben, mert apoptózist vált ki) (2) siRNS ----------------- (szisztémás vagy lokális) (3) siRNS-t kódoló DNS - (szisztémás vagy lokális) (3a) Plazmid DNS (3b) vírus vektorral (lentivírus, adenovírus, adeno-asszociált vírus) lentivírus adenovírus integráció episzóma shRNS RISC Stabil expresszióTranziens expresszió 3b. 1. DICER sejtmembrán magmembrán shRNS siRNS Aktivált RISC mRNS siRNS shRNS-t kódoló DNS dszRNS 3a. 2. 1. LOKÁLIS - SZISZTÉMÁS 25.

33 citoplazma extracelluláris tér Hosszú dszRNS (1) Kémiai szintézis Dicer shRNS-t kódoló DNS shRNS (3a) Plazmid vektor (3b) Vírus vektor siRNS féleségek (2) In vitro transzkripció sejtmag 25.

34 RNS interferencia citoplazma sejtmag shRNS DICER exportin Aktív RISC DICER Egyszálú siRNS Cél mRNS P test Degradált mRNS shRNS: kis hajtű (small hairpin) RNS 25.

35 Y. CRISP: clustered regularly interspaced short palindromic repeats A CRISPR rendszer PAM szekvencia (NGG) genomiális DNS hibajavítás egyező genomiális szekvencia Cas9 guide (vezető) RNS

36 Rekombináns fehérjék Rekombináns fehérjék Milyen betegség ellen? Inzulin diabetes (cukorbetegség) Véralvadás faktorokhemofilia (vérzékenység) Növekedési hormonok:törpeség Előny : nem okozhat betegséget (szemben a korábbi, hullákból nyert faktorokkal) Hátrány : a baktériumokban másként érnek a fehérjék (pl. nincs glükoziláció) 26.

37 Baktérium DNS Nem-integrálódó plazmidok Integrálódó plazmid Genomi DNS Klónozás (ha idegen DNS-t építünk be) 27.

38 Az inzulin hatásai 28. glükóz inzulin glükóz transzporter glikogén szintézis glikolízis inzulin receptor zsírsav szintézis

39 Poliklonális antitestek Memória B sejtek Antigén Antigén injekció az állat testébe B sejt Plazma sejtek Poliklonális antitestek Poliklonális antitesteket tartalmazó szérum az állat véréből 32.

40 Rekombináns inzulin Humán sejt Baktérium sejt plazmid RE emésztés Emberi inzulin gén DNS 29.

41 Protein mérnökség 30. (1)Irányított evolúció: mutagenezis  szelekció  újabb mutagenezis  szelekció … (2)Racionális protein mérnökség: irányított mutagenezis 3D-s modell alapján (1)Irányított evolúció: mutagenezis  szelekció  újabb mutagenezis  szelekció … (2)Racionális protein mérnökség: irányított mutagenezis 3D-s modell alapján

42 Antitest technikák 31.

43 Egy egér immunizálása B sejtek izolálása a lépből Mielóma sejtek tenyésztése A mielóma és a B sejt fúziója A sejtklónok elkülönítése A megfelelő sejtvonalak kiválogatása Sokszorozás in vitro és in vivo Kinyerés 33. 1984 Monoklonális antitestek Az antitest-képző sejtek vándorlása: Csontvelő  lép  vér

44 Monoklonális antitestek Egér lépsejtek (plazmasejtek; nem osztódnak) Néhány sejt ( ) X antigén elleni antitesteket tartalmaz fúzió Transzfer HAT tápfolyadékba Egyedi sejtek külön-külön való tenyésztése Klónok szelekciója X antigénnel való kapcsolódásra TK génben mutáns egér mielóma sejtek nem képesek HAT tápfolyadékban nőni Egér beoltása X antigénnel Nem fuzionált sejtek ( ) elpusztulnak Fuzionált sejtek( ) szaporodnak 34.

45 Plazma sejt Tumor sejt (mielóma) HeterokarionHibridóma sejt Sejtfúzió Szelektív tápfolyadék: csak a hibrid sejtek osztódnak 35. Hibridóma sejtek előállítása

46 Fab fragmens Fc fragmens (antigén kötés) (fiziológiai hatások) 36. Papain enzim bakteriofág Antitest gén Diszulfid kötés gIII gén gIII proteinek Antitest Fab fragmens Variábilis régió Konstans régió Könnyű lánc Nehéz lánc Diszulfid híd Rekombináns antitestek

47 Antibiotikumok Alexander Fleming A penicillin gátolja a baktériumok növekedését baktérium gomba 37.

48 DNS RNS protein plazma membrán sejtfal Sejtfal felépítés (  -laktamáz) Sejtmembrán struktúra és funkció (kolisztin ) Transzláció (tetraciklin) transzkripció (rifampicin ) DNS struktúra és funkció (Nitrimidazol) Folsav szintézis (szulfonamido k) Az antibiotikumok hatása Hogyan védekezik a baktérium? antibiotikum kiáramlási pumpa plazmid antibiotikum rezisztencia antibiotikum megváltoztató enzim antibiotikum degradáló enzim 37. Antibiotikumok