Képalkotó eljárások Spektroszkópiai alkalmazások

Mikroszkópok hagyományos optikai mikroszkóp konfokális mikroszkóp fluoreszcencia-élettartam mérése Endoszkópok, távcsövek Fotoelektron-sokszorozó – sokcsatornás síkdetektor (photomultiplier)(microchannelplate detector) kapuzható képerősítő (gated image intesifier) Streak camera

Bazsalikom levél, szekréciós mirigy az epidermisz felszínén (a kék-zöld fluoreszcencia a sejtfal anyagok pl., ferulasav, viaszok, illetve a flavonoidok fluoreszcenciaja) exc = 351 nm emi = nm kék nm zöld > 650 nm vörös 100  m

Sorghum levél felszine: exc = 351 nm exc = 351 nm emi = nm kék emi = nm kék nm zöld nm zöld > 650 nm vörös > 650 nm vörös A 100  m AB D C BD C 32  m Fluoreszcencia réteg felvételek cirok levélen A felszínen a sejtfal alkotók kék-zöld fluoreszcenciája dominál, beljebb a fotoszintetizáló sejtek klorofilljáé.

 exc = 351, 364nm, Ar laser 505 nm <  em <550 nm  em > 650 nm DanePy infiltrált spenót levél, a felszíntől 15  m mélységben (mezofill sejtek)

Összetett kép (zöld + vörös fluoreszcencia) és intenzitás eloszlás a jelzett egyenes mentén

 exc = 351, 364nm 505 nm <  em <550 nm  em > 650 nm DanePy infiltrált spenót levél, fotoinhibíciós kezelés 45 min után: a levél fotoszintetikus aktivitásának kb. 2/3-a elvész, ha proteináz inhibitor jelenlében végezzük el a kísérletet, akkor kb 15% D1 protein károsodás detektálható jelentős pigment bleach (total pigment) és lipid peroxidáció még nincs 0’45’30’15’

A több-fotonos gerjesztés alapelve

Scales in Microscopy

Conventional light microscopy is limited by diffraction

Approaches in super-resolution light microscopy Schermelleh L, Heintzmann R,. et.al. STED (Stimulated Emission Depletion Microscopy) SIM (Structured Illumination Microscopy) SINGLE-MOLECULE IMAGING (STORM/PALM)

Instrumentation

N-STORM implementation by nikon

Fluorescence lifetime imaging

Hőmérséklet-mérés foszforeszcencia- élettartam alapján

Fotoelektronsokszorozók

Fotoelektronsokszorozó működési elve

Microchannel plate detector működési elve

Kapuzható képerősítő működési elve

Példa a kapuzott képerősítő használatára

Streak camera működési elve

Streak camera használata fotokróm spirobenzopirán vizsgálatában

Egy felvétel

Typical Quantum Efficiency Curves Wavelength (nm) Back-illuminated Front-illuminated MicroLens front-illuminated Gen III+ Quantum Efficiency (%) ‘Virtual Phase’ Front-illuminated

Interline CCD

No Gain EM Gain No Gain EM Gain BODIPY Texas Red EMCCD enhancing conventional epi-fluorescence microscopy?