Szilárd fázisú peptidszintézis

Slides:



Advertisements
Hasonló előadás
A fehérjék.
Advertisements

IZOENZIMEK Definíció: azonos funkció, de: eltérő primer szerkezet,
immunostimulator peptides; muramyl dipeptide tuftsin derivatives
Rézcsoport.
ENZIMOLÓGIA 2010.
DNS replikáció DNS RNS Fehérje
Szabad aminosavak termelésének kimutatása a talajmikroorganizmusok tenyészetében.
Mik azok a fehérjék? A fehérjék aminosavak lineáris polimereiből felépülő szerves makromolekulák. Ezek kialakításában 20 féle aminosav vesz részt.
Eddig csak kvali volt... Kvantitatív proteomika 1) a frakcionálás szintjén Pl. 2D gélek összehasonlítása vizuálisan, komputer programokkal, differenciál.
C mIg H mIg L TCR  TCR  T-SEJT  C V Antigén receptor TCR A B- ÉS T-SEJTEK ANTIGÉN FELISMERŐ RECEPTORAI HASONLÓ SZERKEZETŰEK TCR =  +  A.
Kémiai BSc Szerves kémiai alapok
Sav-bázis egyensúlyok
SÓOLDATOK KÉMHATÁSA PUFFEROLDATOK
FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA
BIOKÉMIAI ALAPOK.
AMINOSAVAK LEBONTÁSA.
BIOKÉMIA I..
A takarmányok összetétele
Új irányzatok a biológiában Fehérjék szerkezete, felosztása
Mérések ellipszométerrel - Fehérjerétegek vizsgálata
Kulcs-zár illeszkedés (Emil Fischer)
Az intermedier anyagcsere alapjai 9.
CITRÁTKÖR = TRIKARBONSAV-CIKLUS
Nem esszenciális aminosavak szintézise
ENZIMEK Def: katalizátorok, a reakciók (biokémiai) sebességét növelik
EGYÉB HATÁSOK AZ ENZIMAKTIVITÁSRA BIM SB 2001 Ionerősség pH Hőmérséklet Nyírás Nyomás (hidrosztatikai) Felületi feszültség Kémiai szerek (alkohol, urea,
Poszttranszlációs módosítások Készítette: Cseh Márton
Peptidszintézis BIM SB 2001 SZINTÉZIS PROTE(IN)ÁZ BONTÁS -CO-NH- (1901)
Szilárd fázisú oligonukleotid szintézis
Egészségügyi Mérnököknek 2010
A "programozott sejthalál" (apoptosis)
Andráskó Melinda, Huszár László, Korpás Gábor, Környei József
ŐSZI RADIOKÉMIAI NAPOK 2004
Hasnyálmirigy Molnár Péter, Állattani Tanszék
EGYÉB HATÁSOK AZ ENZIMAKTIVITÁSRA BIM BSc 2007 Ionerősség pH Hőmérséklet Nyírás Nyomás (hidrosztatikai) Felületi feszültség Kémiai szerek (alkohol, urea,
A biogén elemek.
Aminosavak és fehérjék
Protein szintézis Protein módosítás 3. Protein transzport.
Vízlágyítás.
Vízlágyítás.
49. kísérlet Az ecetsav reakciói
Citromsav, Nátrium-acetát és szőlőcukor azonosítása
48. kísérlet Sók azonosítása vizes oldatuk kémhatása alapján
Előzmények Peptidkémia Analitikai kémia Protein kémia 1923
porfin – hem-proteinek
Oxigéntartalmú szénvegyületek csoportosítása
Arginin ammonifikáció Készítette: Vas Nóra. Arginin ammonifikáció Ammonifikáció mérésére szolgáló labor kisérlet Ammonifikáció fontossága:  Ökoszisztémák.
Lipopoliszacharidok meghatározása talajból
Lipáz enzimaktivtás mérése
Az oldatok.
Szerves vegyületek jellemzése
Tagozat, 10. évfolyam, kémia, 16/1
GLP-1 mimetikumok differenciált terápiája
Vízlágyítás. Ca HCO 3 - Ca 2+ + H 2 O + CO 2 + CO 3 2- CaCO 3 képződés Túl sok CO 2 a vízben --> agresszív CO 2 Túl kevés CO 2 a vízben --> CaCO.
Kémiai reakciók Kémiai reakció feltételei: Aktivált komplexum:
Fehérjeszekvenálás Mikronalalitikai kurzus fehérjeszekvenálás.
Összefoglalás.
A b i o g é n e l e m e k. Egyed alatti szerveződési szintek szervrendszerek → táplálkozás szervrendszere szervek → gyomor szövetek → simaizomszövet sejtek.
A fehérjék biológiai jelentősége, felépítése, tulajdonságai Amiláz molekula három dimenziós ábrája.
OXIGÉNTARTALMÚ SZERVES VEGYÜLETEK OXOVEGYÜLETEK.  Egy oxigénatomos funkciós csoportot tartalmazó vegyületek hidroxivegyületek  alkoholok  fenolok éterek.
AFRIKAI HARCSA GENOM PROJECT Kovács Balázs 1, Barta Endre 2, Pongor Lőrinc 3, Uri Csilla 1, Keszte Szilvia 1, Patócs Attila 3, Müller Tamás 1, Orbán László.
Szénhidrátok. Jelentőségük A Földön a legnagyobb tömegben előforduló szerves vegyületek  lehetnek energiaforrások (cukrok),  tápanyagraktárak (keményítő),
A fehérjék emésztése, felszívódása és anyagcseréje
DNS replikáció DNS RNS Fehérje
Szervetlen vegyületek
A nitrogén és vegyületei
Új molekuláris biológiai módszerek
Analitikai Kémiai Rendszer
ENZIMOLÓGIA.
A minta-előkészítés műveletei
Előadás másolata:

Szilárd fázisú peptidszintézis Bánóczi Zoltán MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoport, Budapest

Peptidek és alkalmazásuk Peptidek aminosavakból felépülő oligomerek. H2N-CH-COOH H2N-CH-CO- HN-CH-CO- HN-CH-COOH R R R n R R: sok féle, 20 fehérjealkotó aminosav „A” és „Aaa” jelentése -HN-CH-CO- Számos alkalmazás R kutatás gyógyszeripar (Inzulin, Glukagon, Octreotide, Oxicotin) édesítőszer (aszpartám: Asp-Phe-OMe) szépségápolás (botox: Clostridium botulinum toxin)

Peptidszintézis - kezdetek Emil Fischer: első peptidszintézis (1903) NH3 BrCH(R)COCl + H2N-CH(R’)CO2H BrCH(R)CONHCH(R’)CO2H H2NCH(R)CONHCH(R’)CO2H Bergmann és Zervas: Z-csoport (1932) Carpino: Boc-csoport (1957) Robert Bruce Merrifield: az első szilárdfázisú peptidszintézis (1963) Carpino: Fmoc-csoport (1972) J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 E. Atherton, R.C. Sheppard: Solid phase peptide synthesis: a practical approach (IRL Press, Oxford, England, 1989) Fmoc-technika

Peptidszintézis - elv H2N-CH-COOH + H2N-CH-COOH R R’ Ezt szeretnénk! -H2O H2N-CH-CO- HN-CH-COOH + H2N-CH-CO- HN-CH-COOH + H2N-CH-CO- HN-CH-COOH R R’ R’ R R R és még sok minden más!!! Megoldás PG-HN-CH-CO-AG + H2N-CH-COOH PG-HN-CH-COOH + H2N-CH-CO-OPG’ R R’ R R’ -H2O -H2O PG-HN-CH-CO- HN-CH-COOH PG-HN-CH-CO- HN-CH-CO-OPG’ R R’ R R’ PG: védőcsoport AG: aktiváló csoport Oldallánc védőcsoportok!!

Peptidszintézis - megvalósítás PG-HN-CH-COOH R PG-HN-CH-CO- HN-CH-CO-OPG’ + H2N-CH-CO-OPG’ -H2O R R’ R’ Hogyan? 1. Aktivált aminosav-származék PG-HN-CH-CO-AG ahol AG: - Cl - N3 - OCO-R’ - OR’ R 2. Közvetlen aktiválás - karbodiimid, DCC, DIC - in situ aktív észter képzés, DCC-HOBt, BOP-HOBt

Peptidlánc felépítése 1. Stepwise (lépésenkénti) szintézis: PG-HN-CH-COOH R PG-HN-CH-CO- HN-CH-CO-OPG’ + H2N-CH-CO-OPG’ -H2O R R’ R’ amino-védőcsoport eltávolítása PG-HN-CH-CO- HN-CH-CO- HN-CH-CO-OPG’ H2N-CH-CO- HN-CH-CO-OPG’ R” R R’ R R’ -H2O + védőcsoportok eltávolítása 1 vagy 2 lépésben PG-HN-CH-COOH R” H2N-CH-CO- HN-CH-CO- HN-CH-CO-OH R” R R’ 2. Fragmenskondenzáció

Miben más a szilárdfázisú peptid szintézis? 1. A C-terminális karboxil-csoport védelme a gyantával kialakított kötéssel. A kötés: - észter - amid H2N-CH-CO- R R’ 2. Az α-amino-csoport védőcsoportja eltávolítható a peptid-gyanta kötés hasadása nélkül. PG: - Boc - Fmoc PG-HN-CH-CO- R R’ 3. Funkciós csoportok védése az oldalláncokban.

Gyantatípusok Gyanta: polisztirol-divinilbenzol kopolimer + polimerizáció + Boc-technika Fmoc-technika Merrifield gyanta Wang gyanta MBHA gyanta Klórtritil gyanta Rink amid-MBHA gyanta

Első aminosav kapcsolása a gyantához MBHA és Rink amid-MBHA, akár a többi aminosavat Merrifield gyanta Boc-Aaa(X)-OCs DMF, 50 °C, 48 h Boc-HN-CH-CO-O R’(X) Wang gyanta: Fmoc-Aaa(X)-OH + DIC + DMAP H2N-CH-CO- R’ Klórtritil gyanta: Fmoc-Aaa(X)-OH + DIEA H2N-CH-CO-O R’

Peptidlánc felépítése In situ aktivészteres kapcsolás Boc-technika DCC HOBt Fmoc-technika DIC HOBt Aminosav származék és kapcsolószerek nagy feleslegben (3 ek.≤)

Funkciós csoportok az oldalláncban Boc-technika Lys Arg Asp, Glu Cys Ser, Thr, Tyr His 2-Cl-Z Tos OBzl OcHex Meb Tyr Bzl 2-Br-Z Dnp

Fmoc-technika Lys Boc Arg Pbf Asp, Glu Cys Ser, Thr, Tyr OtBu His Trt (2,2,4,6,7-pentametil- dihidrobenzofurán- 6-szulfonil) OtBu Trt tBu Bum

Ideiglenes védőcsoport hasítása Boc-technika HN-CH-CO- R R’(X) TFA/DCM + CO2 + +H3N-CH-CO- R R’(X) Fmoc-technika HN-CH-CO- R R’(X) piperidin/DMF + CO2 + H2N-CH-CO- R R’(X)

Boc-technika szintézis protokollja Gyanta mosása 3-szor DCM-nal; 0,5-1,0 perc Boc-csoport hasítása 33% TFA/DCM; 2+20 perc Gyanta mosása 5-ször DCM-nal; 0,5-1,0 perc Semlegesítés 3-4-szer 5-10% DIEA/DCM; 1 perc Gyanta mosása 4-szer DCM-nal; 0,5-1,0 perc Kapcsolás: Boc-aminosav származék-DCC-HOBt DCM-DMF elegyben (3 ekv. A gyanta kapacitásához képest); 60 perc Gyanta mosása 2-szer DMF-dal; 0,5-1,0 perc Ninhidrin (izatin) teszt (-) sárga (+) kék

Fmoc-technika szintézis protokollja (-) sárga Gyanta mosása 3-szor DMF-dal; 0,5-1,0 perc Fmoc-csoport hasítása 2% piperidin + 2% DBU/DMF; 2+2+5+10 perc Gyanta mosása 8-szor DMF-dal; 0,5-1,0 perc Kapcsolás: Fmoc-aminosav származék-DIC-HOBt DMF-ban (3 ekv. A gyanta kapacitásához képest); 60 perc Gyanta mosása 2-szer DMF-dal; 0,5-1,0 perc Gyanta mosása 2-szer DCM-nal; 0,5-1,0 perc Ninhidrin (izatin) teszt (+) kék

Ninhidrin teszt OH H N + NH2-R 2 O OH N O- O O kék λ(570nm) Pro esetén: Nincs különbség a termék és a ninhidrin színe között sárga NH O Teszt oldatok: 40 g fenol 10 mL abs. EtOH-ban 65 mg KCN 100 mL deszt. vízben (2 mL-t higítunk 98 mL piridin-nel) 2,5 g ninhidrin 50 mL abs. EtOH-ban Izatin test: 3% izatin + 5% Boc-Phe-OH benzilalkoholban + ninhidrin teszt oldatok A gyanta színe vörös-fekete

Peptid (védőcsoportok) hasítása gyantáról Boc-technika Van a peptidben His(Dnp)? igen nem Dnp hasítása (tiofenol:DIEA:DMF 3:3:4 (V/V/V)) Van N-terminális Boc-csoport? igen nem Boc-csoport hasítása A peptid (védőcsoportok) kompatibilisek HF, TMSOTf, TFMSA? HF TMSOTf TFMSA Anizole, p-kresol és DTT 10% TFMSA- 10% tioanizol-TFA EDT és m-krezol jelenlétében 1 M TMSOTf-tioanizol/TFA oldat melyben m-krezol és EDT

Van N-terminális Fmoc-csoport? Fmoc-technika Van N-terminális Fmoc-csoport? igen nem Fmoc hasítás Van a peptidben Arg, Met, Trp vagy Trt? yes nem Van a peptidben Arg, Met? „A” hasítási elegy igen nem B: 0,75 g fenol 0,25 mL EDT 0,50 mL tioanizol 0,50 mL deszt. víz 10 mL TFA Van a peptidben Trp vagy Trt? „B” hasítási elegy igen nem „C” hasítási elegy C: 0,25 mL EDT 0,25 mL deszt. víz 9,50 mL TFA A: 0,5 mL deszt. víz 9,5 mL TFA

Peptid tisztítása és jellemzése Valamennyi izolálás liofilizálással történik. Nyers peptidet RP-HPLC-val tisztítjuk. A peptid analitikai jellemzése: - analitikai RP-HPLC - tömegspektrométria

Miért jó a kémiai peptidszintézis? Gén-technológia népszerű, viszonylag olcsó és egyszerű, de csak hosszabb lineáris fehérjék felépítésére alkalmas L-aminosavakból. De nem lehet: D-aminosavak nem természetes aminosavak poszt transzlációs módosítások(Hyp, Pyr, gliko- és foszfopeptidek) nem lehet elágazó láncú vagy ciklikus peptid fluoreszcens vagy izotóp jelölt peptid

Nem természetes aminosavak

https://www. peptechcorp https://www.peptechcorp.com/documents/Unnatural_amino_acids_in_drug_discovery.pdf

Glikopeptidek T. Buskas et al. Glycobiology, 16, 113R–136R, 2006

Elágazó láncú peptidek Hordozó peptidek: H-FRHDSHYX5C-NH2 S-CH2CO-K(S-CH2CO) H-FRHDSHYX5C-NH2 KRRbA-NH2 X=Ø (25, MAP(Ab4-10C)4) H-FRHDSHYX5C-NH2 S-CH2CO-K(S-CH2CO) H-FRHDSHYX5C-NH2 Mező, G., Manea, M. et al. J. Peptide Science 10, 701 (2004) Dendrimer szerkezetű sejtpenetráló oligoargininek vázlatos szerkezete Futaki, S., et al. Biochemistry 41, 7925–7930 (2002)

Ciklikus peptidek Természetes anyagok; antibiotikumok, hormonok, toxinok Térszerkezet rögzítése Enzimstabilitás növelése A) Csak amid kötést tartalmaz - fej-farok - oldallánc is érintett B) diszulfid híd, tioéterkötés, észter (lakton), éter, oxim, tiazolidin … stb.

Fluoreszcensen jelölt peptidek Molekulák nyomon követése – számos jelzőmolekula elérhető. O HO lex = 360 nm lem= 480 nm lex.= 490 nm lem.= 520 nm 4-(7-hidroxikumaril)-ecetsav (Hca) 5-karboxifluoreszcein (Flu) N H S O Na+ H2 O- lex.= 320 nm lem.= 480 nm 5-[(2-aminoetil)amino]napftalin-1-szulfonsav (EDANS)

Ac-CSK(Flu)PIGPDDAIDALSSDFTS-NH2 Hca-RQIKIWFQQNRRMKWKKC-NH2 S Ac-CSK(Flu)PIGPDDAIDALSSDFTS-NH2

H-RQIKIWFQQNRRMKWKKSGKSGMDAALDDLIDTLGG-NH2 Hca-RQIKIWFQNRRMKWKKC-NH2 S-CH2CO-SKPIGPDDAIDALSSDFTS-NH2 H-RQIKIWFQQNRRMKWKKSGKSGMDAALDDLIDTLGG-NH2 A) HcaPenKalpA amid B) HcaPenKalpC tioéter C) HcaPenKalpC tioéter

DABCYL-TPLKSPPPSPRE(EDANS)RRRRRRR-NH2 2. FRET (fluorescence resonance energy transfer) DABCYL EDANS TPLKSPPPSPR N C H 3 O S Na+ O- DABCYL-TPLKSPPPSPRE(EDANS)RRRRRRR-NH2 cszubsztrát= 200 mM. , cKalpainB= 0,5 µM lgerj.=320 nm, lem.= 480 nm Emésztés előtt Emésztés után lgerj. 5 10 15 20 25 30 35 40 350 400 450 500 550 600 650 (nm) F Int.

Hipocampus szöveteket 5 percig kezeltünk a sejtpenetráló szubsztrát oldatával (c=50 mM). Hipocampus szöveteket kezeltünk 5 percig a sejtpenetráló szubsztrát oldatával (c=50 mM), majd kalpasztatin A és C konjugátumot adtunk az elegyhez (c=5 μM) és a kezelést további 15 percig folytatuk. Piramidális sejtek régiója (üres nyilak) és más régiók (tele nyilak).

Házi feladat Hogyan állítana elő védetlen peptidet a következő származékból? Mi keletkezik a folyamat végén? (Több lépés is lehetséges!) Fmoc-Ala-Lys(2ClZ)-Thr(Bzl)-Arg(Tos)-O