Semmelweis Genomikai Hálózat 128. rendezvény MTA Kisérleti Orvostudomány Kutatóintézet; Idegi Sejt- és Fejlődésbiológia Csoport Embrionális, indukált pluripotens és szöveti őssejtek: hol tart a regeneratív sejtterápia? 2014 április Semmelweis Genomikai Hálózat 128. rendezvény

Aszimmetrikus mitózis Őssejt: önmagát megújító + más fejlődési állapotú, fenotípusú utódot lérehozó osztódó sejt Vég-differenciált sejtek „Nyugvó” sejtek Szimmetrikus mitózis + Aszimmetrikus mitózis Sokszorozó sejtek „Új” sejtípust megalapozó sejtek

Fragmentálódó blasztomérák megtermékenyítés 3 nap Fragmentálódó blasztomérák „kompact” embrió Korai blastocysta EB St 1 EB St 2 EB St 2-3 Tágult blastocysta EB St 4 2 nap Lane, Gardner; Best Practice & Research Clinical Obstetrics and Gynaecology 2007

Embrionális őssejtek, ESC Evans , Kaufman, Martin 1981; Thomson 1998 Korai hólyagcsíra (~5. nap) Belső sejtcsomó ICM trofoblaszt Oct4, Aktin, DAPI Embrioid csomó aggregáció 10. nap in vitro 6. nap in vitro „hatching” Sejttípus differenciáció

aggregation ES cell chimera 3.5 days old chimera embryo Chimaera-állatok ES sejtek beépítésével Gócza Elen munkája 1.GFB/B2 ES cell line aggregation ES cell chimera 3.5 days old chimera embryo Transzgenikus állatok Csíra-vonalba beépült génhordozó sejtek chimera new-borns JAX® Mice Strains

ES sejtek közvetlen sejtterápiára nem használhatók ! Tumor-képzés Nem megfelelő szöveti instrukciók Szívizom Zhang et al., Cell Research (2010) :1-9. In vitro: differenciáltatás után szövet-építés BMP, ActivinA, VEGF Válogatott, időzített Növ. Faktor kezelés Gou et al., 2006 Mth.Enzymol retinsav Embrioid csomó Idegi sejttípusok Scaffolds: váz-elemek és letapadási felszínek, amelyek irányítják a sejt-elrendeződést Gyógyszer-tesztelésre alkalmas 3D szerv/szövet-struktúrák Jövőben talán beültethető szövet-pótló elemek

Indukált pluripotens őssejtek (IPSC) Kfl, Oct4, Nanog, Sox2, Myc Visszaprogramozás Indukált pluripotens őssejtek (IPSC) Kfl, Oct4, Nanog, Sox2, Myc Epigenetikus hatások: növ. faktorok (?) Sejt-stresszorok: pH ES-szerű állapot (azonos gondok) Indukált pluripotens őssejtek : IPSC Őssejt-gének bevitele osztódóképes szöveti sejtbe Nem végdifferenciált sejt IPSC IPSC sejtvonal Sejtterápiára nem alkalmas Visszaprogrammozni csak nem-végdifferenciált sejtet lehet ! Különböző szöveti progenitorokból nyert IPSC-k fejlődési potenciálja azonos? Előnye: saját testből nyerhetők ; személyre szabott citogenetika, gyógyszer-tesztelés; Talán egyszer, saját-szövet implantátum; sejtterápia

In vivo Beágyazódás Magzati szöveti őssejtek trophoectoderma ICM méhfal 13. nap 0,4 mm 18. nap 1,25 mm 32. nap; 6 mm Magzati szöveti őssejtek hólyagcsíra petevezető In vivo Beágyazódás 16 .nap

Dopaminerg idegsejtek LC: locus coeruleus T: thalamus Hy: hyppocampus LTA: lateral tegmental area HC: hippocampus ST: striatum SN: substantia nigra (A8, A9) VTA: ventral tegmental area (A10) B.olf.: Bulbus olfactorius (A16) SCN: suprachiasmatic nucleus HC: hyppocampus R: raphe magok Noradrenerg idegsejtek Szerotonerg idegsejtek Dopaminerg idegsejtek Septum medialia: Ch1 nucl.fasc. diagonalis: Ch2, Ch3 nucl. basalis Meynerti : Ch4 nucl. pedunculopontis: Ch5 nucl. tegment. Laterodorsalis:Ch6 medialis habenula : Ch7 Nucl. parabigeminal : Ch8. Kolinerg idegsejtek Gerincvelő ventrális rétegek: Motoneuronok, g-efferensek, vegetatív „motoneuronok”

E9 NE-4C embryonic mouse neuroectodermal stem cells RA 0 RA 5 RA 9 p53 - / RA 0 m 10 20 RA 5 100 RA 9 GFAP RA 14 20 mm RA 2 10 m IIIb-tub RA 10 Syn I SSEA-1 RA 0 1 m Schlett, Madarász J. Neurosci.Res. 1997

Adult mouse radial glia-like stem cells Markó et al., PlosOne, 2011

* Fate of NE-4C neural stem cells in early embryonic brain D9 40 mm NeuN bIII tubulin 40 mm D9 Demeter et al., 2004. Exp. Neurol.

Post-implantation period [weeks] Fate of NE-4C cells implanted into the adult mouse brain Volume of NE-4C aggregates / brain 7 1 2 3 4 5 6 (n=5) (n=4) x10-1 mm3 D 21 SVZ ventricle Post-implantation period [weeks] In the adult brain parenchyma, NE-4C cells could survive for less than 6 weeks; long-term survival was detected only along the wall of lateral ventricles, a region of adult-hood neurogenesis Demeter et al., Exp.Neurol., 2004.

Fate of NE-4C cells implanted into the new-born brain 100 mm % Frequency of animals carrying grafted cells* 40 45 50 55 60 65 70 75 35 New born Adult Post-implantation period [weeks] 1 2 3 4 5 6 * 100% = total number of implanted animals investigated at the designed date Tumor-like, expanding inclusions, without high-scale differentiation Demeter et al., Exp.Neurol., 2004.

In lesioned brain region, NE-4C cells survive and grow, but do not differentiate; 500 mm Control Lesioned implanted cell volume Post-implantation period (days) The fate of neural stem cells is governed by their environment Ágoston et al., Neuropath, Appl.Neurobiol, 2007

Large-scale cell production upon injury Resident glial (?) progenitors in the fibre tracks Baumann 2007. Phys.Rev. Zadori et al., 2011

Sokszorozó progenitor → Őssejt 2 HSC NSC ESC Szimmetrikus mitózis + Aszimmetrikus mitózis 1 önmegújító + 1 differenciáltabb utódsejt Végdifferenciált szöveti sejt Őssejt 1 ECM Laterális indukció / gátlás ? Őssejt 1’ Sokszorozó progenitor → Őssejt 2 X Egyetlen szervben is változó szöveti „elkötelezettség”, osztódó képesség, osztódási gyakoriság, környezeti érzékenység gén-expressziós mintázat Sokféle, különböző „őssejt” létezik egyidejúleg Jellemzésük hiányos; Kevés a szelektív marker! Ramalho-Santos, Science 2002 Sokszorozó progenitor → Őssejt 4 Sokszorozó progenitor → Őssejt 3

MSC: Regeneratív segítő hatások Intravénás beadás NSS: neurologic severity score; TBI: traumatic brain injury

Szaruhártya limbus-régió Specializált vascularis niche az őssejt-zóna A felnőttkori SVZ neurogén zóna Vérképző Bőr germinatív réteg Bélhám - kripták Szaruhártya limbus-régió a felnőtt SVZ egy kiterjedt planáris vaszkuláris plexust tartalmaz osztódó őssejtek (B sejt) és transit-amplifying sejtek (C sejt) szorosan asszociáltak ehhez asztrociták az ependymán átnyúlva a CSF-el érintekzenk, végtalpaikkal ereket fonnak körbe de nem minden érszakaszhoz asszociálnak (microdomains!) Sokszorozó progenitorok különböző szövetekben Kötőszövet : fibroblast Mesenchyma (?) Perifériás IR: satellit sejtek „nyugvó” sejtek: a szöveti regeneráció kiinduló sejtjei Tavazoie, Doetsch et al. 2008 Sikeres terápiás sejtpótlás alap-feltétele: i) a megfelelő fejlődési állapotú sejt a saját „niche”-be kerül ii) fennmaradásuk, normális szaporodásuk és differenciálódásuk egymásra épülő lépéseit a környezet támogatja

Őssejt-terápia regenerációt segítő hatásai: Terápiás sejtpótlás: Ős/progenitor sejtek Sajátságaik, leszármazásuk, fejlődési lehetőségeik nem tisztázottak Ős/progenitor sejt-környezet („niche”) Szövetenként, sejt-típusonként változó; összetételét ma kellő mértékben nem ismerjük A végdifferenciált szövetek nem biztosítanak normális túlélési, fejlődési lehetőségeket a saját, vagy kívülről bevitt, differenciálatlan őssejtek számára: a kompakt szervek sejtpótló terápiája ma kísérleti fázisban van; szakmai fejlesztést, etikai, törvényi szabályozást igényel Őssejt-terápia regenerációt segítő hatásai: Gyulladást gátló faktorok Sejt-túlélést, differenciálódást segítő növekedési faktorok

Egyéb érett szövetek esetén ma NEM terápia, de fontos ember-kísérlet Sejtterápia működik, ha őssejtet őssejt-környezetbe juttatnak (Csontvelő; bőr) Egyéb érett szövetek esetén ma NEM terápia, de fontos ember-kísérlet http://www.clinicaltrials.gov http://stemcells.nih.gov/

International Society for Stem Cell Research ISSCR International Society for Stem Cell Research http://www.isscr.org /www.egeszseg.origo.hu/page/download/ossejt_handbook.pdf Guidelines for the Clinical Translation of Stem Cells December 3, 2008 1) Bevezető: Miért van szükség útmutatóra? 2) Nem-igazolható, „üzleti” őssejt-beavatkozások 3) Az őssejt-alkalmazások felelőssége 4) A sejt-források és a sejt-készítmények előállításának, kezelésének szabályai 5) Pre-klinikai vizsgálatok 6) Klinikai vizsgálatok 7) Őssejtek felhasználása egyedi klinikai indikációk esetén 8) Társadalmi kontroll és jogi szabályozás 9) Az útmutató eredményektől függő felülvizsgálata Függelékek: az őssejtekkel és alkalmazásaikkal kapcsolatos alapvető információk http://blogs.nature.com http://stemcells.nih.gov