Szalontai Gábor 2014 november 5. NMR spektroszkópia (vegyész mesterkurzus: VEMKSI 4312S) Polarizáció-átvitel dipolárisan csatolt magok között: - mag Overhauser hatás (NOE) - csere-spektroszkópia (DNMR) (55 ábra) Szalontai Gábor 2014 november 5.

Cél = térszerkezet vizsgálat Alapja: mágnesezettség-átvitel = polarizáció-átvitel Magtávolságok becslése, mérése Érzékenységnövelés (13C, 29Si, …103Rh, stb. magok mérése) Segítség a hozzárendelésben

Mágnesezettség (polarizáció) átvitel: eredendő jelerősség (1H vs Mágnesezettség (polarizáció) átvitel: eredendő jelerősség (1H vs. 13C magpár)  négyszer annyi proton mag van az alsó szinten mint a 13C !  a proton négyszer olyan erős dipól mint a 13C !  a protonok négyszer olyan gyorsan precesszálnak mint a 13C -k! tehát 4*4*4 = 64 = g3 -szor erősebb lesz a proton jele! Ráadásul: mivel a 13C természetes előfordulás csak 1,1 %. 

Elvi maximumok (besugárzott mag : 1H) Mért mag (X) Giromágneses állandó, g [rad T-1 s-1]×10-7 Max. NOE hatás I=Io(1+gH/2gX) Max. polarizáció átvitel I=Io| gH/gX| 13C 6,726 2.99 3.98 15N -2,711 -3,94 9,87 103Rh -0.84 -14,89 31,78

Emlékeztető (1): a relaxáció és mérése Inverzió 180o(x) Beolvasás 90o(x) Az inverzió (átfordítás) óta eltelt t idő

Emlékeztető (2): a relaxációs mechanizmusok Csak a dipoláris mechanizmus felelős a NOE effektusért!

Emlékeztető (3). Feltétel olyan molekuláris mozgások megléte, amelyek frekvenciája a Larmor frekvenciák tartományába esik.

Példa nagy molekulára: ciklodextrin (-D-glucopyranose)-n OH (3) OH (2) 2 3 5 1 4 CH2-OH (6) As most of you certainly know they are macrocyclic carbohydrates contructed from identical glucopyranosyl (glucose units) rings. The alfaCD was selected for our purposes, it has well defined structure (a conical shaped container) with a cavity diameter of 5.7 angström (wide upper rim) what limits the possible guests …. a-CD : 174 Å3 b-CD : 262 Å3 g-CD : 427 Å3

Példa eltérő méretű molekulák (a-CD és etanol (ms= 46 ) keverék) relaxációja t megfelelő megválasztásával elérhető, hogy csak a gyorsabban relaxáló molekula (esetünkben az a-Ciklodextrin ms=974) jelei látszanak!

A mag (Nuclear) Overhauser (NOE) jelenség: szelektív vagy szélessávú besugárzás hatására bizonyos magok jeleinek intenzitása megváltozik !!! (valójában a mag relaxáció egy válfaja, eredetileg elektron-mag párokon tapasztalta Overhauser)

NOE jelenség: végy egy dipolárisan csatolt I,S magpárt (DIS > 0 Hz) (4N mag) és alkalmazz szelektív telítést (S)! bb N - d Dm átme-netek egyen súlyban S telítése után 1 I d S ab, ba 2 aa, bb 2d S = w1S I = w1I ab N ba N I = w1I S = w1S aa N + d bb N - d/2 S = w1S I = w1I ab N-d/2 ba N +d/2 I = w1I S = w1S aa N + d/2

A NOE lényege: S mag besugárzása következtében fellépő I mag betöltöttség-szint változás (inkoherens polarizáció-átvitel) A NOE mértéke: W0, W1 és W2 a zéró-, az egy- és a két-kvantumos relaxációs folyamatok valószínűségét jelentik

NOE = f(relaxációs szintek = 1/w) = hs(I) Az átmenetek valószínűsége a szintek betöltöttség-különbségével arányos, egy-kvantumos átmenet esetén ez: Ahol r az I és S magok távolsága tC a molekuláris korrelációs idő wI és wS az I és S magok Larmor frekvenciái

NOE = f(relaxációs szintek = 1/w) = hs(I) Az átmenetek valószínűsége a szintek betöltöttség-különbségével arányos, zéró-kvantumos átmenet esetén ez: Ahol r az I és S magok távolsága tC a molekuláris korrelációs idő wI és wS az I és S magok Larmor frekvenciái

NOE = f(relaxációs szintek = 1/w) = hs(I) Az átmenetek valószínűsége a szintek betöltöttség-különbségével arányos, két-kvantumos átmenet esetén ez: Ahol r az I és S magok távolsága tC a molekuláris korrelációs idő wI és wS az I és S magok Larmor frekvenciái

Emlékeztető: egy- és több-kvantum koherenciák: egyszerűsített fizikai kép (AX rendszer) SQ: DM= +/- 1, ezek észlelhetőek... A X MQ: DM= +/- 2, 3, ... mindig antifázisúak és emiatt nem észlelhetőek... nA + nX

Több-kvantum koherenciák tulajdonságai A rendűséggel (p) arányosan változnak az átmenetek frekvenciái (p*f1). Ahol f1= a gerjesztő rf tér frekvenciája. Ennek megfelelően változnak a fáziscsúszások is a gerjesztő impulzus szögéhez képest (p*f1)… A zéró-kvantumos átmenetek függetlenek ettől a hatástól. Gerjesztési eljárás: 90o-t-180o-t-90o (p=2, 4, 6, ...stb)

A homonukleáris NOE maximális értéke (ha w2t22 << 1) Független a két mag távolságától!!? W0, W1 és W2 a zéró, egy és két-kvantumos folyamatok valószínűségét jelentik

A heteronukleáris NOE maximális értéke (ha w2t22 << 1) W0, W1 és W2 a zéró, az egy és a két-kvantumos folyamatok valószínűségét jelentik

A NOE függése a molekuláris mozgásoktól: a molekulaméret, az oldószer (viszkozitás), és a hőmérséklet hatása NOE maximum mw = 1000-2000 között W2~ W0 ROESY 0,5 wtC >> 1 mw > 2000 W2< W0 wtC << 1 kis és közepes molekulák W2> W0 -1,0 NOESY

A mért NOE-kból számolható (becsülhető) magtávolságok Két-spin esetek: ahol p* = egyéb egy-kvantumos dipoláris relaxációs hozzájárulás tC = molekuláris korrelációs idő Relatív magtávolságok két eltérő molekulán mért NOE értékek alapján csak akkor összevethetőek, ha .... tC azonos a két mintában teljesül a w2t2C << 1 feltétel p* közel azonos a két molekulában Több-spin esetek egy molekulán belül: hA(B) = hC(B) = 0,5 is lehet! A növekedés léte még nem elegendő bizonyíték a két mag „közelségére” ... A növekedés hiánya még nem elegendő bizonyíték a két mag „távoliságára” ...

Egyensúlyi NOE hatások mérése : kvázi folyamatos besugárzással egy új egyensúly jön létre! A NOE felépülést mérő eljárások: a besugárzás időtartama rövid a relaxáció idejéhez képest!

"Tranziens" NOE-k mérése két dimenzióban (NOESY kísérlet) 1 H 180 o pulzus 90 "kemény" akvizició a kiválasztott átmenet szelektív átfordítása egy 180 -os pulzussal NOE felépülési szintet mér, ami ~ r 6 IS "Tranziens" NOE-k mérése egy dimenzióban: a besugárzás szelektív és sokkal rövidebb mint a relaxációs időállandó! t M "Tranziens" NOE-k mérése két dimenzióban (NOESY kísérlet) f( M) akvizició keveredési idõ ~ T

Szelektív spin-lecsatolás: B2 = lecsatoló tér Emlékeztető: a kettős-rezonancia kísérletek (B1, B2) (I) Szelektív spin-lecsatolás: B2 = lecsatoló tér

Kettős-rezonancia kísérletek (II): szélessávú protonlecsatolás X {1H}: fenn: normál X spektrum {1H} középen: protoncsatolt X spektrum lenn: NOE nélküli X spektrum (mennyiségi kiértékelés)

Homonukleáris NOE kísérlet: Ez is szelektív besugárzás: B2 = szelektív tér Heteronukleáris NOE kísérlet: 13C{1H} 31P{1H} 15N{1H} 29Si{1H} hmax= 0,5*gH/gX 1,98 1,14 -2,94 -0,52

2D eljárások: tranziens NOE mérése a molekula összes magja között: NOESY = DQF-COSY tm keveredési idő t2 állandó t1változó 90o(x) 90o(x) B1(90o)x Mz=Mcos2pnt1 COSY Mx=Msin2pnt1 NOESY B1(90o)x

2D NOESY Csak a zéró-kvantumos z-mágnesezettséget kell megőriznünk, az egy- és két-kvantumos koherenciák kidobandók pl. egy nyolclépéses fázisciklus alkalmazásával!

NOESY: nem kívánt mellékhatások, egyéb komplikációk A NOE csak a z-mágnesezettséget befolyásolja (zéró rendű, ZQC), tehát érzéketlen az rf impulzusok fázisára (tehát a fázisléptetésre immunis!) Zéró rendű koherenciák azonban létrejönnek a (NOESY= DQF-COSY) szekvenciában a J-csatolt magpárok között is! Ezektől kell megszabadulni, hiszen ezek COSY keresztcsúcsokat produkálnak! a COSY eredetű zeró kvantumos (ZQC) koherenciák intenzitás változásai Dtm kis mértékű, véletlenszerű változtatása törli a COSY eredetű keresztcsúcsokat! NOE Dtm keveredési idő, tm

A keveredési idő, tm helyes megválasztása: mennyi időt hagyjunk az átvitelre? NOESY keresztcsúcs intenzitások kis molekulák: gyors molekuláris mozgás A kísérlet kulcsa Dtm helyes megválasztása: kis molekulák (< 500 D) esetében a becsült T1 körüli (0.5 – 2.0 s) érték általában megfelelő. Nagyobb molekulák esetében (1000-2000 D között) a jel elveszhet. Igazán nagy molekulák (a negatív NOE-k tartománya) esetén 0.5*T1 az ajánlott érték! keveredési idő, tm nagy molekulák, viszkózus oldatok: lassú molekuláris mozgás

Tranziens NOE: kinetika, mérés a lineáris növekedés tartományában NOE ~ 1/rIS-6 NOE NOE(S) = k’ *rIS-6*tC a lineáris növekedés tartományában a magok izolált spin-párként viselkednek, ezt lehet kihasználni a távolság mérésére! Dtm NOE= kereszt-relaxációs szint

Vége az első résznek … Most néhány alkalmazás következik és az alapvető 1D és 2D NOESY és ROESY szekvenciák szintén alkalmazási példákkal fűszerezve.

Alkalmazási példák: magtávolság, rAB mérés - ha a molekuláris korrelációs idő, tc ismert, rAB közvetlenül számolható (tc meghatározható pl. a 13C relaxációs idő mérésekből) - gyakoribb megoldás egy ismert rXY referencia távolság használata (pl. két metilén proton távolsága állandónak tekinthető ~1.4 Å) ηA(B)/ηX(Y) = rAB-6 / rXY-6 Figyelem: dinamikus átlagot kapunk!

2D eljárás: NOESY példák (ciklosporin (undekapeptid) C6D6) Gradiens-segített fázisérzékeny NOESY A keresztcsúcsok fázisa ellentétes a diagonálison levőkhöz képest (csak a pozitív NOE tartományban mw < 1000 ) A kémiai csere (lásd később) viszont a diagonálissal azonos fázisú jeleket hoz létre, ennek alapján ezek könnyen megkülönböztethetőek!

2D eljárás: NOESY (pravastatin, noesy-gp-ph) Gradiens-segített fázisérzékeny NOESY A keresztcsúcsok fázisa azonos a diagonálison levőkével (csak a negatív NOE tartományban van így, mw = 409 !!) )

NOESY-GP-PH szélessávú proton lecsatolással: 2D eljárások: NOESY példák (szekvencia: noesy-gp-ph) 31P-31P térbeli korreláció NOESY-GP-PH szélessávú proton lecsatolással: Csak a 195Pt -31P szatellit jelei mutatnak egymással keresztcsúcsokat, ezek feltehetően a 195Pt spin-állapotváltozásai (relaxáció) miatt fellépő csere-keresztcsúcsok! A fázisuk megegyezik a diagonálison lévő jelekével! A főcsúcsok (a 193Pt-hoz kötött 31P magok) nem mutatnak térbeli közelséget vagy cserét!

1D NOESY szekvenciák: differencia spektroszkópia 2. 1. tm keveredési idő 90o(x) t2 állandó 180o(x) szelektív átfordító impulzus 1 - 2 = differencia spektrum = NOE hatások Általában pontos mag távolság meghatározásra használják, több keveredési idővel veszik fel a spektrumokat, amelyek egy referencia („üres” helyen gerjesztett) spektrumot is magukba foglalnak ... A differencia –spektroszkópia összes hátránya jelen van!

Szelektív differencia NOE vs. 1D gradiens NOESY Double Pulse Field Gradient Spin Echo: kiválasztja (előjelét átfordítja) a kérdéses rezonanciát és csak az ebből származó polarizációt tartja meg, a többit a gradiensek szétszórják! Csak a növekedést mutatja ott, ahova a polarizáció került differencia spektroszkópia nélkül! A viszonylag hosszú tm (>300 ms) alatt a „szétszórt” mágnesezettség is relaxál, ezért nem kívánatos z-komponensek jelennek meg, ezeket egy négylépéses fázisciklus (EXORCYCLE) kiszűri, mert nem teljes, hanem csak kis jelekről van szó. tm keveredési idő 180o(x) szelektív impulzus 90o(x) 180o(x) szelektív impulzusok 90o(x) 90o(x) 90o(x) „tiszta fázisú” gerjesztési profilt eredményez! z-gradiensek Shaka et al. J.Magn.Res. 125, 302-324 (1997)

Tranziens vs. egyensúlyi NOE (a tranziens eljárás sajátságai) a növekedés igen erősen függ a használt keveredési (csere) időtől, a növekedés függ a kiválasztott (besugárzott) jel inverziójának (átfordításának) pontosságától is, a százalékos növekedés számítása nem egyszerű, az átfordított jel itt nem használható egyszerű referenciaként és az inverziót is skálázni kell 100 %-ra, a növekedés százalékos abszolút értéke kisebb lesz mint az egyensúlyi NOE esetében, de általában jobban észlelhető!

Tranziens vs. egyensúlyi NOE: 1D példák (1) pravastatin (tranziens NOE) A fázisciklus miatt fellépő kivonási maradék (selnogp szekvencia) (180o, pulzus forma = GAUSS 1.100) szelektív besugárzás: 5.5 ppm, 88 ms, 67 dB, gerjesztett tartomány kb. 25 Hz!

NOESY vs. Rotating frame nOE SpectroscopY NOE maximum mw = 1000-2000 D között W2~ W0 ROESY 0,5 ROESY Az átmeneti tartományban a leghasznosabb, ahol a NOESY keresztcsúcsok nagyon kicsik, változó előjelűek vagy teljesen hiányoznak!! log(wtC) wtC >> 1 mw > 2000 W2< W0 wtC << 1 kis és közepes molekulák W2> W0 -1,0 NOESY

ROtating frame noE SpectroscopY A hagyományos NOESY mérés (z polarizáció változást mérünk) legnagyobb problémája, hogy wotC ~ 1 közelében (1000- 2000 D) nincs jól mérhető jel! Viszont a spin-lock tér* (tranzverz polarizáció létezik) körülményei között a molekula méretétől függetlenül gyakorlatilag csak növekedés van , nagyon nagy molekulákra a maximális ROE érték az elméleti NOE kétszerese! Lásd a kereszt-polarizációra vonatkozó alábbi összefüggést! wtC >> 1

ROESY: a hagyományos 1D eljárás tm keveredési idő 90o(x) t2 (állandó) 180o(x) szelektív impulzus gB1 << gBo tehát w1tC << 1 Az ún. spin-lock tér (B1) ideje alatt (keveredési idő) változnak meg a Z-szint betöltöttségek a dipolárisan csatolt magok között!

ROtating frame noE SpectroscopY: mit jelent a forgó koord ROtating frame noE SpectroscopY: mit jelent a forgó koord. rendszer és a spin-lock tér? Spin-lock tér: a Hartmann-Hahn feltétel teljesülése alatt a mágnesezettség az Y-tengely mentén helyezkedik el … 180o(x) szelektív impulzus 90o(x) szélessávú gerjesztés NOE kísérlet a forgó koordináta rendszerben: ROE (tranzverzális) tranziens NOE kísérlet: (longitudionális)

Rotating-frame Overhauser SpectroscopY: 2D tm spin-lock keveredési idő 90o(x) t1 idő Spin-lock tér y A protonok azonos effektív teret éreznek, csak a homonukleáris J és D-csatolások aktívak, így polarizáció-átvitel játszódik le a dipolárisan csatolt spinek között!! 180o(y) Spin-lock tér y (homonukleáris spin-echo kísérlet) d d n

Rotating-frame Overhauser SpectroscopY: zavaró jelek - COSY keresztcsúcsok (J-csatolás). TOCSY átvitel a J-csatolt magok között a spin-lock tér ideje alatt. rf off-rezonancia hatások miatt keresztcsúcs gyengülés lép fel.

ROESY vs. NOESY : pravastatin só mw= 409 (anion)

ROESY pravastatin 400 ms DMSO ns=8 t=5 h d1=4s TD=512 (F1) A keresztcsúcsok fázisa ellentétes a diagonálison lévő jelekével! Kivéve a kémiai csere következtében fellépő keresztcsúcsokat!

NOESY pravastatin só: 400 ms DMSO ns=8 t=2,5 h d1=4s TD=256 (F1) A keresztcsúcsok fázisa azonos (?) a diagonálison lévő jelekével, annak ellenére, hogy viszonylag kis molekuláról van szó (400-500 D)! Szokatlan eset!! Gyengék a jelek, különösen az F1 dimenzióban. A csere- keresztcsúcsok itt nem azonosíthatóak!

Kétdimenziós csere-spektroszkópia (EXchange SpectroscopY, EXSY) A kémiai környezet változása következtében változó mag környezet természetesen befolyásolja a spektrumot. Hasonlóan a NOE hatásokhoz a csere is csak a z-mágnesezettséget befolyásolja (zéró rendű), tehát érzéketlen az rf impulzusok fázisára! A detektálás feltétele: a folyamatnak lassúnak kell lennie a vizsgált mag NMR időskáláján (külön jeleket kell látnunk), de nem szabad túl lassúnak sem lennie, mert a relaxáció korlátot szab a jel detektálásának. Ez azt jelenti, hogy a detektálható cseresebességek, kex kb. a 103- 10-3 s-1 tartományban vannak!

A dinamikus NMR jelenség A spin-állapotok véges időtartamának hatása az NMR jelek félérték-szélességére. (a) csere nélküli állapot, csak T2 által meghatározott (b) csere által megszélesített jelalak (egy véges időtartamú állapot energiája nem határozható meg pontosan)

2D eljárások: csere mérése a molekula összes magja között: szekvencia = DQF-COSY = NOESY = EXSY tm (keveredési) csere idő t1változó akvizició 90o(x) 90o(x) B1(90o)x Mz=Mcos2pnt1 COSY Mx=Msin2pnt1 EXSY = NOESY B1(90o)x

2D eljárások: csere-spektroszkópia (EXSY) (példa az azonos fázisra) Csere-keresztcsúcsok: fázisuk azonos a diagonális fázisáéval! NOE-keresztcsúcsok: ezek fázisa is azonos a diagonálissal, mert a molekula mérete miatt ( ~ 5000 D) a negatív NOE tartományban vagyunk!

2D eljárások: csere-spektroszkópia (ROESY-EXSY) (példa az eltérő fázisra) Csere-keresztcsúcsok: fázisuk mindig azonos a diagonálissal! A ROE-keresztcsúcsok fázisa mindig ellentétes a diagonálissal.

Ajánlott irodalom NOE, NOESY: Dinamikus NMR: D.Neuhaus and P.Williamson: The NOE in Structural and Conformational Analysis VCH Publisher, 1989 Weinheim Dinamikus NMR: Jackman-Cotton 1975, Academic Press Delpuech 1995, Wiley