ELSŐDLEGES ANTIGÉN – ELLENANYAG KAPCSOLÓDÁSON ALAPULÓ PREPARATÍV ÉS ANALITIKAI MÓDSZEREK

Immunaffinitás kromatográfia ELISA – Enzim kötött immunszorbens esszé ELISA plate különböző koncentrációjú mintákkal a szubsztrát hozzáadását követően ELISA plate különböző koncentrációjú mintákkal az enzimreakció leállítását követően

AZ IMMUNOESSZÉK ÉRZÉKENYSÉGE

ELLENANYAG TISZTÍTÁS ANTIGÉN IMMUNSZORBENSEN oszlop polimer gyöngyök oszlop töltelék „affinity purified antibody” : a katalógusokból rendelhető ellenanyagokat ezzel a módszerrel tisztítják rákötött antigének

A TISZTÍTÁS LÉPÉSEI Tisztítandó ellenanyagok hozzáadása Kötődés Mosás Elúció

ANTIGÉNTISZTÍTÁS Tisztítandó oldat felvitele Kötődés Mosás Elúció oszlop Kötődés oszlop töltelék Mosás polimer gyöngy Elúció hozzákötött antigén specifikus ellenanyagok Tisztított antigén

IMMUNPRECIPITÁCIÓ egy adott fehérje izolálása és koncentrálása sok fehérjét tartalmazó mintákból fehérje kölcsönhatások vizsgálata (pl. jelátvitelben résztvevő molekulák vizsgálata) A bakteriális A/G fehérje egy rekombináns fúziós fehérje, mely erősen kötődik az immunglobulinok Fc-régiójához. http://en.wikipedia.org/wiki/Immunoprecipitation

ELISA Enzyme Linked Immune Sorbent Assay ELISA plate (lemez) lyuk avagy kút Különböző lemezek – különböző természetű molekulákhoz

felülethez, vagy ellenanyagokhoz kötődő antigének/ellenanyagok enzyme linked immune sorbent enzim felülethez, vagy ellenanyagokhoz kötődő antigének/ellenanyagok ellenanyaghoz konjugált enzim

AZ ELISA VIZSGÁLATBAN AZ MENNYISÉGÉVEL ARÁNYOS MÉRTÉKŰ VÁLTOZÁST DETEKTÁLUNK Az enzimaktivitás mértékére a katalizált színreakció mértékéből következtethetünk Hasonló elméleti alapokon nyugszik az összes elsődleges antigén-ellenanyag kölcsönhatáson alapuló immunoassay

Szekunder ellenanyagok AZ ELISA, IMMUNHISZTOKÉMIA, CITOMETRIA SORÁN HASZNÁLT MÓDSZEREK ALAPTÍPUSAI Direkt módszer Indirekt módszer Jelzés Szekunder ellenanyagok Jelzés Primer ellenanyag Antigén

Enzim-antienzim rendszer AZ ELISA, IMMUNHISZTOKÉMIA, CITOMETRIA SORÁN HASZNÁLT MÓDSZEREK ALAPTÍPUSAI Enzim-antienzim rendszer PAP – peroxidáz / anti-peroxidáz APAAP – alkalikus foszfatáz / anti-alkalikus foszfatáz Enzimek A primer ellenanyaggal azonos (izo)típusú enzim-specifikus ellenanyag Szekunder ellenanyag (faj v. izotípus specifikus) Primer ellenanyag Antigén

Biotin-avidin rendszerrel kombinált indirekt módszerek AZ ELISA, IMMUNHISZTOKÉMIA, CITOMETRIA SORÁN HASZNÁLT MÓDSZEREK ALAPTÍPUSAI Biotin-avidin rendszerrel kombinált indirekt módszerek Az avidin nagy affinitással képes a biotint kötni Egyszerű ABC Avidin Biotin Complex Jel felerősítése Avidin-enzim komplexek Biotin = B7-vitamin / H-vitamin Avidin = tojásból izolált molekula, mely az eddig ismert legerősebb másodlagos kölcsönhatást kialakítva köti a biotint (Feltételezhetően antibakteriális tulajdonsága miatt található meg a tojásokban. Egyes Streptomyces baktériumfajok is termelnek avidint (streptavidin) mely a kolonizációban biztosít számukra előnyt a többi megtelepedni próbáló baktériumfajjal szemben.) Biotin-enzim komplex Avidin Biotinált ellenanyag Antigén

KOMBINÁLT „SZENDVICS” ELISA Kis koncentrációjú antigének (pl. citokinek, hormonok) kimutatása szendvics technikával. Szérumok, nem tiszta oldatok vagy keverékek esetén is ez használható (pl. liquor). nem kötődő anyagok kimosása citokin specifikus ”capture” ellenanyagok kitapasztása felesleges fehérjék kimosása telítés: a szabad plasztikfelület beborítása aspecifikus fehérjével felesleges ellenanyagok kimosása felesleges konjugátum kimosása citokin tartalmú minta hozzáadása eltérő antigén determinánst felismerő biotinilált ellenanyagok hozzáadása avidinnel konjugált enzim hozzáadása színreakcióhoz szükséges anyagok hozzáadása

EGYSZERŰ INDIREKT ELISA LÉPÉSEI Antigén specifikus ellenanyag, vagy az antigén egyszerű kimutatásához Példa: HIV fertőzöttség diagnosztikája a páciensben megjelenő HIV specifikus ellenanyagok kimutatásával - rekombináns HIV fehérje, vagy annak megfelelő szintetikus peptid segítségével felesleges antigén kimosása felesleges fehérjék kimosása az antigén kitapasztása (coating avagy fedés) felesleges ellenanyagok kimosása telítés: a szabad plasztikfelület beborítása aspecifikus fehérjével specifikus ellenanyagok hozzáadása enzimmel konjugált szekunder ellenanyagok hozzáadása színreakcióhoz szükséges anyagok hozzáadása HIV burokfehérje, vagy nagy méretű szintetikus peptid

KOMPETITÍV ELISA Érzékenysége miatt szolubilis fázisban levő kis mennyiségű antigén kimutatásához használják. A mintában jelenlevő ismeretlen mennyiségű oldott antigén hozzáköt az ellenanyagokhoz, és így gátolja azok hozzákötődését a rendelkezésre álló, korábban a szilárd fázishoz tapasztott tisztított antigénhez. - A tisztított antigén kitapasztása a szilárd fázishoz és blokkolás - Az ismeretlen mennyiségű, szolubilis antigént tartalmazó vagy nem tartalmazó minta hozzáadása Jelölt ellenanyag hozzáadása, kötődés - Mosás - Kromogén anyagok hozzáadása

Ez az a tartomány, ami a koncentrációt jellemző értékeket ad A standard hígítási sora OD Ismeretlen koncentrációjú minta Az összehasonlíthatósághoz az ismeretlen mintából is hígításokat kell csinálni! Ez az a tartomány, ami a koncentrációt jellemző értékeket ad Az optikai denzitás alpján bármelyik lehetne ? 500 250 125 62 31 16 7.8 3.9 1.9 1000 0.97 0.49 0.24 0.12 0.061 0.030 0.015 0.007 0.004 koncentráció Szerencsés esetben, a minta OD-je a lineáris szakaszra esik, és nem kell hígítani.

BIOAKTÍV ANYAGOK KIMUTATÁSA hCG (human coriogonadotropin) – terhességi tesztek Tumor antigének kimutatása Citokinek, hormonok kimutatása doppingvizsgálatok: EPO (erithropoetin), szteroid származékok kimutatása szendvics technikával vagy kompetitív tesztekkel

TUMORDIAGNOSZTIKA A tumor specifikus (TSA,TSTA) és tumor asszociált (TAA) antigéneket felismerő ellenanyagok felhasználhatóak a diagnosztikában Szendvics technikával ezek az antigének kimutathatóak Tumor Ag specifikus capture ellenanyaggal (a kit része) fedett felület Tumor Ag specifikus detektor/reporter ellenanyag (a kit része) Tumor antigén (pl. a beteg szérumából) Prosztata daganatok prosztata-specifikus antigén (PSA): Szérum koncentrációja magas a prosztata rákos, benignus prosztata hiperpláziás (BPH) és prosztatitiszes páciensekben  nem specifikus, de a PSA szérum szintje korrelál a prosztata daganat méretével és a klinikai állapotával (monitorozásra alkalmas) hasonlóan felhasználható a prosztataspecifikus savas foszfatáz (PAP) mennyiségi kimutatása a szérumból

immunoblot (Western blot) immunhisztokémia AZ ELSŐDLEGES ANTIGÉN – ELLENANYAG KAPCSOLÓDÁSON ALAPULÓ PREPARATÍV ÉS ANALITIKAI MÓDSZEREK immunoblot (Western blot) immunhisztokémia

WESTERN BLOT Lépések: minta előkészítés (szöveti vagy sejtes) gél elektroforézis blotolás jelölés előhívás Anode(+) Nitrocellulóz vagy Polyvinylidén Fluorid (PVDF) membrán Cathode(-) Felhasználás: fehérje keverékek egyes komponenseinek ellenanyag segítségével történő kimutatására

WESTERN BLOT Western blot SDS-PAGE Membrán Az egyik leggyakrabban alkalmazott olyan módszer a molekuláris biológiában amiben ellenanyagokat használnak SDS-PAGE gél  a minta fehérje komponenseinek elválasztása molekulatömegük alapján (átfedés is lehetséges) Membránhoz való hibridizálást követően a vizsgált fehérje kimutatása specifikus ellenanyaggal történik Fehérje detektálás specifikus ellenanyag-epitóp kölcsönhatás alapján Protein minta Standard Western blot SDS-PAGE Membrán

WESTERN BLOT Segítségével egy adott fehérje jelenléte kimutatható a mintában Az egymástól elektroforézissel elszeparált fehérjéket /Nátrium-Dodecyl Szulfát-Polyacrylamid Gélelektroforézis (SDS-PAGE)/, membránra transzferálják Primer ellenanyagot (monoklonális vagy poliklonális) használnak a vizsgált fehérje kimutatásához Enzimmel (pl. torma-peroxidáz) konjugált szekunder ellenanyag segítségével mutatják ki a primer ellenanyag kötődését

WESTERN BLOT Kimutatási eljárások: Kolorimetriás (peroxidáz enzim – denzitometria / spektrofotometria) Kemilumineszcens (ECL) Radioaktív (izotóp – RTG) Fluoreszcens (jelölés – CCD camera) 24

MEGNÖVELT KEMILUMINESZCENCIA /Enhanced chemiluminescence (ECL)/ H2O2 jelenlétében a torma-peroxidáz (HRP) oxidálja a diacilhidrazidokat (pl luminol) Az oxidáció hatására a luminol gerjesztett állapotba kerül és egy fotont bocsát ki, hogy visszatérjen az alapállapotba A kibocsátott foton fényérzékeny filmmel, vagy kamerával detektálható A fénykibocsátás fenol vázzal rendelkező molekulák (pl 6-hidroxi-benzothiazol) jelenlétében körülbelül 1000-szeresére növelhető (enhancer) Immobilizált proteinek Primer ellenanyag Fab Fc Torma- peroxidáz luminol H2O2 h Epitóp a protein felszínén luminol enhancer H2O detektálás Szekunder ellenanyag Membrán

IMMUNCITOKÉMIA / IMMUNHISZTOKÉMIA Jelzéssel ellátott, antigén-specifikus ellenanyag mutatja meg az antigént a szövettani metszetben, vagy a sejtszuszpenzióban Immunfluoreszcencia fluoreszcensen jelzett ellenanyag FITC – fluoreszcein izotiocianát (zöldessárga) PE – fikoeritrin (narancssárga) Immunoenzim módszer enzimmel konjugált ellenanyag P – peroxidáz AP – alkalikus foszfatáz (a szubsztrátból oldhatatlan, színes csapadékot képeznek) A grafikonokon a ellenanyaghoz konjugált FITC és az R-fikoeritrin (R-PE) emissziós spektruma látható. (Hullámhossz az x tengelyen, emitált fény intenzitás az y tengelyen. A zöld és sárga sáv a FITC és PE detektálásához általánosan használt fényszűrők hullámhossz szélességét szimbolizálja)

IMMUNHISZTOKÉMIA Festés előtti metszet FIXÁLÁS METSZÉS Szövetminta FAGYASZTÁS

Sejtek (sejttenyészetek) IMMUNHISZTOKÉMIA Enzim Biotin ABC komplex: biotinált ellenanyag avidin biotinált enzim Avidin Szekunder antitest Primer antitest Tárgylemez Sejtek (sejttenyészetek) Szövetmetszet

Hagyományos hisztokémia Hagyományos hisztokémiával csak kevés sejttípust tudunk azonosítani Hagyományos hisztokémia Akut bronchopneumonia (hematoxilin-eozin festés) Viszonylag kevés sejttípus azonosítható

(CD68+ makrofágok és limfociták által képzett granulóma) CD68 – különféle leírások szerint sokféle immunsejt expresszálja (B, T, DC, Granulociták, MF) Intracelluláris expresszió!!! szöveti metszetekben gyakran használják makrofág azonosításra CD68 is a glycoprotein which binds to low density lipoprotein. (de nem azonos az LDL-Receptorral) Immunhisztokémia (CD68+ makrofágok és limfociták által képzett granulóma)

Antinukleáris (ANA) ellenanyagok kimutatása SLE-s személy szérumából, sejtkultúrában (Hep-2), immunofluoreszcencia segítségével (indirekt jelölés)

Aktin mikrofilamentek kimutatása (TRITC) TRITC konjugált anti-aktin ellenanyagokal Aktin mikrofilamentek kimutatása (TRITC) Lehetőség van részletes morfológiai információk kinyerésére (lásd a további ábrákat is)

Fixált és permeabilizált bőr fibroblaszt Mitokondrium F-aktin Sejtmag Fixált és permeabilizált bőr fibroblaszt. A mitokondriumok kimutatásához egér IgG-t (anti–OxPhos Komplex V) és Alexa Fluor 555 festékkel konjugált kecske anti-egér IgG-t használtak. Az F-actin jelölése Alexa Fluor 488 festékkel konjugált phalloidinnel (gombatoxin) történt, a sejtmagot TO-PRO-3 jodiddal festették meg. TO-PRO-3 jodid duplaszálú nukleinsav festék Quinolinium, 4-[3-(3-methyl-2(3H)-benzothiazolylidene)-1-propenyl]-1-[3-(trimethylammonio)propyl]-, diiodide falloidin – gombaméreg, ciklopeptid (duplagyűrűs heptapeptid) polimer aktint köt, aktin depolimerizációt gátol Fixált és permeabilizált bőr fibroblaszt Mitokondrium F-aktin Sejtmag

Fixált és permeabilizált tüdőartéria endothel sejt Peroxiszómák kimutatása fixált és permeabilizált endotél sejtben (pulmonáris artéria). A peroxiszómák detektálásához peroxiszómális membrán protein 70 elleni monoklonális egér ellenanyagot és Alexa Fluor 488 festékkel jelölt kecske anti-egér IgG-t használtak. A mitokondriumokat MitoTracker Red festékkel jelölték meg a fixálás előtt; a sejtmag kimutatása DAPI festékkel történt. DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, dilactate) Fixált és permeabilizált tüdőartéria endothel sejt Peroxiszóma Mitokondrium Sejtmag