A P elem technikák: enhanszerek és gének csapdázása Génmanipuláció ecetmuslicában: P elem technikák A P elem technikák: enhanszerek és gének csapdázása

A mutátor elem felépítése meghatározza a P elem mutagenezis jellegét enhanszer csapdázás – génexpresszió, mutagenezis, klónozás Géncsapdázás – génexpresszió, mutagenezis, klónozás irányított génexpresszió – génfunkció vizsgálata, kölcsönhatások epitóp jelölés – géntermékek követése és tisztítása, in vivo analízis irányított génszupresszió – génfunkció vizsgálata, null fenotípus helyspecifikus rekombináció- génfunkció vizsgálata, többfunkciós gének irányított géncsere – mutagenezis, gén és protein funkció vizsgálata

A P-lacW enhanszer csapdázó elem felépítése Hsp70 terminátor szekvencia enhanszer P promóter gén lacZ mini-white ori amp E B Génexpresszió követését teszi lehetővé Marker gén lehetővé teszi a P elem követését Bakteriális szekvencia a DNS klónozást teszi lehetővé P{PZ} enhanszer csapdázó elemben a rosy marker gén található a mini-white helyett

A patched gén közelébe inszertálódott P-lacZ elem expressziós mintázata imágókorongokban szárny szem

A P-Gal4 alapú enhanszer csapdázás mechanizmusa Hsp70 terminátor szekvencia enhanszer P promóter gén Gal4 mini-white ori amp E B Gal4 lacZ/gfp detektálás 5xUAS

GFP riporter expressziója P-Gal4 enhanszer csapdázó vonalakban

Enhanszer csapdázó inszerciók létrehozása P-lacZ mutátor törzs transzpozáz forrás W- P(Δ2-3), Sb X Y TM6, Tb P(w+) P-lacZ W- P(Δ2-3), Sb W- X Y W- „jump-starter” hímek Y W- P-lacZ P-lacZ W- vagy Y lacZ expressziójának detektálása

A enhanszer csapdázás előnyei A riporter gén expressziója speciális sejtmarkerként használható Követhetők a sejtek az egyedfejlődés során Egyedi identitást adhat a sejteknek olyan stádiumban, amikor morfológiailag még nem különülnek el Gyakran nem érinti a gén funkcióját, vagy hipomorf allélt eredményez Egyszerű mutációs analízist, és gyors klónozást tesz lehetővé

Az enhanszer csapdázás korlátai Sok enhanszer csapdázó inszerció nem okoz mutációt Nem mindig egyértelmű, hogy egy enhanszer szekvencia melyik gén expresszióját befolyásolja Gyakran az érintett gén távol helyezkedik el az enhanszertől Egy riporter gén aktivitását egyszerre több enhanszer szekvencia is befolyásolhatja

A kettősen jelölő pGT1 géncsapdázó elem felépítése SD Gal4 hs-neo mini-white promóter exon1 exon2 exon3 poli-A poli-A exon1 Gal4 mini-white exon2 exon3 poli-A w+ szemszín Gal4 lacZ/gfp detektálás 5xUAS

A P elem technikák: irányított génexpresszió Génmanipuláció ecetmuslicában: P elem technikák A P elem technikák: irányított génexpresszió

Irányított génexpresszió a Gal4 moduláris rendszerben - 1 Hsp70 terminátor szekvencia enhanszer P promóter gén Gal4 mini-white ori amp E B Gal4 vizsgált gén 5xUAS

Irányított génexpresszió mechanizmusa -2 promóter UAS mini-white ori amp gén Gal4 mini-white ori amp

Enhanszer csapdázás különleges esete: sejtek eliminációja Hsp70 terminátor szekvencia enhanszer P promóter gén Gal4 mini-white ori amp E B Gal4 gyilkos gén 5xUAS ricin, diftéria toxin reaper, grim, hid tetanusz toxin

Az epitóp jelölés mechanizmusa SD mini-white GFP FRT FRT FLP rekombináz SA SD promóter exon1 GFP exon2 exon3 poli-A GFP poli-A

GFP epitóppal jelölt proteinek kifejeződése