Az apoptózis =programozott sejthalál (PCD) Multicelluláris szervetekben a fölösleges vagy potenciálisan veszélyes sejtektől meg kell szabadulni. Erre rendeltett a genetikailag szabályozott aktív folyamat az apoptózis.

Apoptózis Nekrózis A sejthalál két szélsőséges típusa A homeosztázis genetikailag Szabályozott fenntartására Egyedfejlődés és differenciálódás Sejtek pusztulnak az embriogenezis során A sejtszám és szövetméret szabályozása Felnőtt egyedben azonos szövetméret mellett az elöregedett sejtek elpusztulnak és új sejtek keletkeznek Immunszabályozás A immunsejtet 90 %-a differnciálódás során elpusztul Az immunválasz az aktíválódott sejtek apoptózisával fejeződik be Mutáns sejtek pusztulása Szövetsérülés, véletlenszerű Cell shrinkage Cell swelling Apoptotic bodies Cell lysis Apoptózis Változások: Membrán Sejt zsugorodás Apoptótikus testek Mitokondrium Sejt duzzadás Sejt lízis Sejtmag Citoplazma Nekrózis

Morfológiai különbségek az apoptózis és nekrózis között Sejt duzzadás, felkerekedés A membránintegritás gyors elvesztése, festék felvétel Nincs mag és DNS degradáció A sejttartalom kiürül Gyulladás indukciója Membrán hólyagok Membrán asszimetria felbomlása, a foszfatidil szerin a belsö membrán felületről a külső felé fordul. A citoplazma zsugorodása Fehérje lebomlás, sejt zsugorodás Sejtmag kondenzáció (a lamin hálózat széttörése) Magi DNS fragmentálódása Apoptótikus testek kialakulása A citoplazma nem ürül ki, nincs gyulladás indukció nekrózis apoptózis egészséges reverzibilis duzzadás irreverzibilis duzzadás sejt szétesés kondenzáció, hólyagok fragmentálódás másodlagos nekrózis ép mitokondrium intact membrán apoptótikus testek változások a magban ép kromatin mitokondriális változások membrán széttörés Morfológiai különbségek az apoptózis és nekrózis között

Soron kivüli apoptózis az agyi neuronokban: Hibák az apoptózisban Soron kivüli apoptózis az agyi neuronokban: Neurodegenerativ betegségek: Alzheimer és Parkinson kór Elmaradt apoptózis: Rák, autoimmun betegségek

1. Iniciáció: A sejtek „halál” szignált kapnak: Az apoptózis fázisai 1. Iniciáció: A sejtek „halál” szignált kapnak: szükséges túlélési faktorok hiánya tápanyagok hiánya halálreceptorok keresztkötése szubnekrotikus koncentrációjú toxinok fizikai stressz: hő, sugárzás, oxidativ stressz 2. Effektor fázis: a halál szignálok metabolikus reakciókra fordítódnak és a sejtek elkötelezik magukat az öngyilkosságra korai változások a membrán struktúrában katabolikus enzimek aktíválódása 3. Degradációs fázis DNS fragmentálódás és masszív fehérje degradáció sejtfragmentek apoptótikus testekbe csomagolódnak a szomszédos sejtek eltávolítják az apoptótikus testeket

ICE-szerű proteáz kaszkád Kromatin kondenzáció és Az apoptózis biokémiai mérföldkövei ICE (interleukin-1 converting enzyme)-szerű proteázok: caspase: C(cisztein)aspase (aspartát): asparaginsav mellett hasítanak Kaszpáz aktívált endonuk- leázok: aktívált DNA-ázok felhaso- gatják a DNS-t Flipázok: membránnal hatá- rolt apoptótikus testek ki- alakulása, a szomszédos sejtek eltüntetik az apoptótikus testeket Makrof’ágok ICE-szerű proteáz kaszkád Kromatin kondenzáció és DNS degradáció fagocitózis kaszpázok endonukleázok flipáz membrán fehérje DNS

Membrán blebbing Membran hólyagok Membrán asszimetria felbomlása, a foszfatidil szerin a belsö membrán felületről a külső felé fordul. Intracelluláris tér Apoptótikus stimulus AnnV+/PI+ Intracelluláris tér Membrán bleb transzlokáz A membrán asszimetria elvesztését a külső felszínre forduló foszfatidil-szerin (PS) jelenlétével mérhetjük. A fluoreszcens festékkel (FITC) jelölt AnnexinV a PS-hez kapcsolódik és ezt citofluorimetriás méréssel vizsgálhatjuk. AnnV-/PI- AnnV+/PI-

Fehérje és DNS fragmentálódás A citoplazma zsugorodása Fehérje lebomlás, sejt zsugorodás Sejtmag kondenzáció (a lamin hálózat széttörése) Magi DNS fragmentálódása Kaszpáz kaszkád Kaszpázok fehérje 0h 6h 12h PARP DPARP A citoszkeletális fehérjék, a nukleáris lamin hálózat és más fehérjék, pl. a DNS repair enzim, a poli-ADP ribozil polimeráz (PARP) proteolízise Mérés: A sejtek permeabilizálása révén a fragmentált DNS kijut a sejtekből, így alacsony (sub-G1) DNS tartalmú sejtpopuláció alakul ki. A celluláris RNS emésztése után a DNS propidium jodiddal (nukleinsav festék) festhető és a DNS tartalom FACS-szal mérhető. Klasszikus DNS létra kb 200 bázispáros darabok agaróz gélben

A sejt feldarabolódása, apoptotikus testek Apoptótikus testek kialakulása A citoplazma nem ürül ki, nincs gyulladás indukció

Az apoptózis kezdete, választási lehetőség Halál szignálok: I.tipusú, extrinsic A halál receptorok keresztkötése II. tipusú. intrinsic Stressz szignálok, mint a Túlélési faktorok hiánya, növekedési faktorok hiánya Szűk tápanyagforrás (pl. szérum éhezés) Szubnekrótikus károsodás:toxinok, hő, sugárzás sugárzás Vírus öngyógyítás káros hatás károsodott sejt drogok kijavított sejt apoptózis

Mitokondriális (II. tipus) Receptor mediált (I. tipus) Az apoptózis típusai Mitokondriális (II. tipus) Közvetlenül a mitokondriumra hatnak az oxidatív stressz, sugárzás, bizonyos drogok Mitokondriális membránpotenciál csökkenése, citokrom C és apoptózis indukáló faktor (AIF) felszabadulása. Apoptoszóma kialakulása a citC, Apaf1 (citoplazmában elhelyezkedő Apoptótikus Proteáz Aktiváló Faktor) és a kaszpáz 9 kölcsönhatásával. Receptor mediált (I. tipus) TNF receptor család és ligandjaik: TNFR1 Fas (CD95) TNF FasL DR3 DR4 DR5 Apo3L/TRAMPL Apo2L/TRAIL DISC kialakítása (halál indukáló szignál komplex= death inducing signalling complex) protein-protein kölcsönhatásokkal, és a kaszpáz (C) kaszkád beindulása : Iniciátor C8 és 10 és effektor C3 A két útvonal között párbeszéd van

Receptor-Based Induction of Apoptosis TNF Supergene family ligands Receptoron keresztül történő apoptózis indukció: TNF receptor szuperfamilia és ligandok Receptor-Based Induction of Apoptosis TNF Supergene family ligands TNFR1 (p56,CD120a) DR4, DR5 (Apo2,TRAIL-R2) (TRICK2,KILLER) DR3 (Apo3,TRAMP, LARD) CD95 (Fas, Apo1) TNF and LTa Apo3L(TWEAK) Apo2L/TRAIL CD95L(FasL) TRADD RIP FADD PRD: proli-rich domain PLAD: pre-ligand-binding assembly domain. trimerizáció a ligandkötés előtt A halál receptorok a Tumor Nekrózis Faktor Receptor (TNFR) családba tartoznak : Cisztein gazdag extracelluláris domain Konzerváltság az intracelluláris domainben-”halál domain” (“death domain “=DD) A ligandok a TNF gén szupercsaládba tartoznak szolubili vagy membrán kötött fehérjék: TNFa=Tumor Necrosis Factor TNFb=Limfotoxin FasL=Fas Ligand TRAMPL=TNF Related Apoptosis-inducing Membrane Protein Ligand TRAIL=TNF Related Apoptosis-Inducing Ligand

Kaszpázok, a végrehajtók A kaszpázok enzimatikusan inaktiv formában szintetizálódnak: A pro-enzimek három domaint tartalmaznak: Az N-terminális prodomaint és a p20 és p10 domaineket, amelyek az érett enzimek alkotórészei. Az érett enzimek két p20-ból és két p10-ből álló heterotetramerből épülnek fel két aktív hellyel. Specifitás: aszparaginsav mellett hasítanak (az N terminális felé eső négy aminosavban levő különbségek biztosítják a szubsztrát specifitást). (caspase=cystein aspartase) Aktiváció: A kaszkád fehérje-fehérje lölcsönhatások révén aktíválódik. zimogén aktív heterotetramer

A DISC (Death Initiating Signaling Complex) kialakulás alapja a fehérje-fehérje kölcsönhatás FADD (Fas Associated Death Domain) & TRADD (TNFR Associated Death Domain :adaptor Proteinek Iniciátor kaszpázok a 8 és 10, pro-kaszpáz alakban nem aktív: A DISC-hez kapcsolódva oligomerizálódnak és autokatalízissel aktíválódnak Példák a domain proteinekre & TRADD DD Hasonló a hasonlóhoz: DD-DD, DED-DED Pro-kaszpáz 8 és 10 DD= Death Domain: a halál receptorok intracelluláris domainben és az adaptor fehérjékben DED= Death Effector Domain: adaptor proteinekben és kaszpázokban

Fas-ligand vagy anti-Fas Death domain a DISC felépítésében Fas-ligand vagy anti-Fas FAS keresztkötés DISC DED Kaszpáz kaszkád aktiváció Kaszpáz 8 Sejt halál sejtmag DNS fragmentálódás Kaszpáz-aktívált DNáz CAD inhibitor

Iniciátor kaszpázok aktiválódása és szabályozása DISC: Procasp-8 és -10 aktiváció Homotipikus asszociációk a DD és DED domének között DD - FADD - DED - DED DED - DED - procasp-8 halálR -DD “induced proximity” - autokatalitikus hasítás Szabályozás: DED - DED c-FLIPS Inhibítor: FADD és procasp-8 interakció gátlása DED - DED - mut. procasp-8 c-FLIPL Modulátor?: dimerizálódik a procasp-8-cal, de az nem hasítódik és a DISC-ben marad

A halál receptoron keresztül érkező jelek szabályozása Apoptózis: HalálR DD és FADD (TRADD) DD FADD DED és procasp8 DED casp8* casp3* és bid hasítás,1/A casp-8 aktiváció: casp-3 aktiváció, Bid hasítás (mitokondriális út aktivációja) Túlélés: RAIDD a RIP-pel és TRAF-fal kölcsönhat NFkB és Jnk aktiváció anti-apoptotikus FLIP és cIAP-k expressziója FLIP gátol, mert elfoglalhatja a procasp8 asszociációs helyét, vagy a procasp8-cal kapcsolódhat (a casp. prodomain nem hasad le, mégis aktíválódik, apoptotikus?) cIAP-k közvetlenül gátolják a casp3-at. A CrmA a casp8 aktivitást gátolja RAIDD: RIP Associated Inhibitory Death Domain: adaptor DED és DD RIP: Receptor Interacting Protein DD és kináz domain TRAF: TNFR associated factor c-FLIPL : Flice-Inhibitory Protein: két DED-t és inaktív casp-like domaint tartalmaz (Cys→Tyr) cIAP: cellular Inhibitor of Apoptosis Protein CrmA: tehénhimlő vírus Cytokine Response modifier: serpin (Serine Protease Inhibitor

MTP nyitás (mitokondriális tranziciós pórusok) Apoptózis indukciója a mitokondriumon keresztül oxidánsok glukokortikoidok oxidánsok MTDNS lebomlás Bcl-2 család: anti-apoptótikus: Bcl-2 Bclx pro-apoptótikus: Bax Bad, etc MTP nyitás (mitokondriális tranziciós pórusok) Apoptózis

A Bcl-2 fehérje család Bcl-2 (B-cell lymphoma 2) : follikuláris B sejtes limfómákban kromoszóma transzlokáció miatt magas expressziót mutat Bcl2 család 3 csoportja: anti-apoptotikus pro-apoptotikus BH3-only A BH1-4 a-helikális régiók erősen konzerváltak a C terminális hidrofób régiója segíti a fehérjék membránokkal való asszociációját segíti. BH: Bcl2 homology domain Fig. 1. The Bcl-2 protein family. Most anti-apoptotic Bcl-2 family members express four Bcl-2 homology domains (BH) as well as a putative transmembrane domain (TM) responsible for their preferred localization at inner membranes. The pro-apoptotic Bcl-2 family members can be divided into two groups. Whereas members of the Bax sub-family resemble Bcl-2 closely in structure possessing three out of four BH domains the more distantly related ‘BH3-only’ proteins only share one BH(3) domain with all other Bcl-2 family members. Also depicted are the orphan members of the Bcl-2 family Bcl-G, Bfk and Bcl-rambo that possess a varying number BH-domains. Their role in normal physiology is currently unknown.

Anti-apoptotikus tagok Jellemzők: BH1-BH4 domain, a BH4 specifikus az anti-apoptotikus tagokra TM-transzmembrán szakasz: a Bcl-2 a mitokondrium külső membránjában helyezkedik el, a Bcl-XL és Bcl-w csak stimulációra kerül a mitokondriális membránba minden magvas sejtben jelen van legalább az egyik anti-apoptotikus fehérje szerepük a mitokondrium membrán stabilitásának fenntartása, a pro-apoptotikus tagok gátlása B-cell lymphoma 2 Bcl-extra long Myeloid cell leukemia factor-1 Bcl-2 homolog of ovary

Pro-apoptotikus tagok 1 Bax csoport BH1-3, nincs BH4! Bax és Bak minden sejtben jelen van, mindkettő deléciója szüséges az apoptózis teljes hiányához Bcl-2-associated X protein Bcl-2 antagonistic killer Bcl-2-related ovarian killer

Pro-apoptotikus tagok 2 “csak BH3” (BH3-only proteins) Bcl-2 interacting killer Bcl-2 antagonist of cell death BH3 interacting domain death agonist Bcl-2 interacting mediator of cell death Bcl-2 modifying factor hara-kiri “damage” p53 promoter-upregulated modulator of apoptosis A BH3-only fehérjék különböző post-transzlációs módosításokon esnek át. A Bim és Bmf a mikrotubulusokon illetve az aktin vázon tárolódnak. A Bad foszforilált állapotban a 14-3-3 scaffold fehérjével kapcsolódnak. A Bid prekurzorként szintetizálódik. A háromszög a molekulákon a BH3 domaint mutatja. a Hrk, Noxa, PUMA transzkripció szinten szabályozott, a p53 indukálja, a DNS-sérülés, oxidatív stressz, kemoterápiás szerek hatására

Forrás: www.sghms.ac.uk

A Bcl-2 család szerepe a homeosztázis fenntartásában Az anti-apoptotikus tagok potenciális onkogének, állandó magas expressziójuk tumoros transzformációhoz vezet : Bcl-2 - limfómák, mellrák, hasnyálmirígyrák Bcl-xL - egér mieloid és T-sejtes leukémia A pro-apoptotikus tagok tumor szupresszorok, funkcióvesztő mutációjuk gyakori a daganatos betegségekben: Bax és Bak mutáció emésztőszervrendszeri rákban, leukémiákban, agydaganatokban… Puma hiánya – gliómák, limfómák, tüdőrák Bid hiánya – leukémiák Bad állandó foszforilációs állapota (PTEN mutáció  Akt aktiváció) - melanoma

Apoptózis indukció mitokondriális komponensei oxidánsok ceramid kaszpázok Apaf1: Apoptotic Protease- Activating Protein1 inaktív Apaf-1 CARD: CAspase Recruitment Domain (kaszpázhoz kapcsolódó adaptor fehérje aktív Apaf-1 Kaszpáz 9 Aktíválódott kaszpázok Apoptózis

A kromoszómális DNS degradációja g-sugárzás, anti-tumor drogok Párbeszéd a receptor és mitokondrium mediált apoptózis útvonalak között Halál faktorok Növekedési faktorok Fas ligand Fas Death domain 1 foszforiláció kaszpáz 8 mitokondrium Proteáz kaszkád 3 1. A kaszpáz 3 hasítja a Bid pro-apoptótikus molekulát amely a mitokondriumra hat. 2. DNS károsodás során a p53, tumor szuppresszor a pro-apop-tótikus Bcl2 fehérjének, a mito-kondriumban lokalizálódó Bax-nak az expresszióját stimulálja. 3. Tirozin kináz növekedési faktor receptorok foszforilálják a Bad-ot, amely így a 14-3-3 scaffold fehérjéhez kapcssolódik, és inaktiválódik. citokróm C kaszpáz 3 2 halál szubsztrátok proteolízise kaszpáz 9 CAD: kaszpáz aktívált deoxyribonukleáz sejtmag A kromoszómális DNS degradációja g-sugárzás, anti-tumor drogok

Az apoptotikus sejtek eltakarítása Az apoptotikus testeket a szomszédos sejtek v. a professzionális fagociták (monocita/makrofág, dendritikus sejtek) takarítják el. A fagocita sejtek gyulladáscsökkentő citokineket, IL-10 és TGF-b, termelnek Az apoptótikus testek fagocitózisának elmaradása súlyos patológiás következményekkel jár: másodlagos nekrózis során, a membránsérülése miatt, a sejtalkotók az extracelluláris részbe jutnak, ahol potenciális antigének v. mérgezők lehetnek. Az apoptotikus sejtek eltávolítását szolubilis és membránkötött molekulák indítják el: - “keress meg” jelek (find-me) - “egyél meg” jelek (eat-me) - “ne egyél meg” jelek (don’t-eat-me)

A fagociták toborzása (find-me szignál) A fagocita sejteket az apoptotikus sejtekből felszabaduló kemoattraktáns, a lizofoszfatidil-kolin (LPC) vonzza oda. Casp3 foszfolipázA2 aktiváció Foszfatidil-kolin hasítása LPC+arachidonsav

A fagocitózist kiváltó jelek (eat-me, don’t-eat-me) A fagocitasejt felszínén megjelenik a foszfatidil szerin (PS) receptor, az annexin családba tartozó Annexin I (AnxI az intracelluláris térből transzlokálódika felszínre) és felismeri az apoptotikus sejtek sejtfelszíni PS-jét. - az élő sejtekis kapcsolatba léphetnek a Mf-okkal (pl. azok adhéziós molekuláival, CD31), de az élő sejtek fagocitózist gátló jelet közvetítenek. - az apoptotikus sejt, membrán-összetételének megváltozása miatt, már nem közvetít elutasító jeleket, hanem a bekebelezésre serkent. Pl. a PS R ligandkötése a membrán betűrődését, makropinocitózist okoz.

A p53 (tumor szuppresszor) szerepe a sejt túlélés és tumor kialakulás szabályozásában A sejtek választása a túlélés (G1 ciklusban maradás és DNS repair) vagy az apop- tózis között a bejövő szignálok végső integrálódásától függ: Sejt típustól Onkogén státustól Extracelluláris növekedési és növekedés gátló faktorok szig- náljaitól A stressz szignálok (UV, su- gárzás, oxidativ stressz) intenzitásától A p53 más fehérjékkel történő specifikus kölcsönhatásától A DNS károsodásra adott válasz DNS károsodás DNS repair az osztódás előtt A p53 szint a G1 stop előtt megemelkedik apoptózis Nincs p53 Nincs G1 stop Osztódás a károsodással: Mutáció, aneuplodia Mitózis elmaradása, sejthalál Genotoxikus stressz (mutáció, DNS törések) aktiválja a p53 –at, amely stimulálja a pro-apopto- tikus Bcl2 fehéjék (Bax, Bad, PUMA, Noxa) expresszióját, vagy aktiválhatja a casp2-t a PIDD (p53-induced protein with a death domain) cytC felszabaduláshoz vezetve. Számos tumorban a p53 funkcióvesztéses mutációja mutatható ki.

Tumor metasztázis és az apoptotikus szignálok kivédése Az apoptózis a metasztázis soklépcsős akadálya 1. A tumor sejtek metasztatikus vándorlásuk során elszakadnak szöveti környezetüktől. A kötőszövettől való elszakadás az apoptózis egyik formáját az anoikist okozza. Az ECM-től kapott jelek hiányában összeomlik a citoszkeletális hálózatÚ amorfózis 2. Az érfalon való átjutás fizikai stresszgapoptózis 3. Az immunrendszer sejtjei, főleg az NK sejtek felismerik a tumorosan transzformált sejteket g apoptózis 4. Az új szöveti környezetben tápanyaghiány lép fel az erek hiánya miatt g celluláris stressz ECM:extracelluláris mátrix NK: természetes ölő sejtek

Anoikis-szel és amorfózissal szembeni rezisztencia Anoikis és amorfózis: az adherens sejtek elvesztik a kontaktust az ECM-mel HGF: Hepatocyte Growth Factor FAK: Focal Adhesion Kinase MAPK: Mitogen Activated Protein Kinase XIAP: X-linked mammalian Inhibitor of Apoptosis ECM Metasztatikus sejtekben: 1. FAK aktiváció az integrin-ECM kölcsönhatás nélkül 2. BCl2, BCl-XL, XIAP megnövekedett expresszziója Anoikis-szel és amorfózissal szembeni rezisztencia

A tumorok kivédik az immunválaszt A vérkeringésbe lépve, a tumorsejteket egyrészt az érfalon való átjutás okozta mechanikai stressz, másrészt az immunsejtek támadása veszélyezteti. A perforin mediált NK ölést az NKG2D receptor és a target sejten megjelenő ligand kölcsönhatása váltja ki. AZ NK sejtek stimuláció hatására TRAIL és CD95(Fas)L-ot expresz-szálnak és a TRAILR-t és CD95-t hordozó tumorsejt apoptózisát okozza. Ezért a tumorsejtek inkább a ligandokat expresszálják és így immunprivilégiumhoz jutnak.

A tumorok megtapadása a másodlagos szövetben Kedvezőtlen Kedvező A tumorsejtek CD44-et (hialuronsav receptor) expresszálnak, amely az ECM komponensekhez kötik a tumorsejteket. Új erek képződése nélkül nem élnek túl, ezért angiogén faktort, VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor)-et termelnek