Tuboly Eszter Tanársegéd Sebészeti Műtéttani Intézet Állatkísérletek az orvostudományban- In vitro modellek élő állatok helyettesítésére Tuboly Eszter Tanársegéd Sebészeti Műtéttani Intézet

Az alternatívák szükségessége Élő modellek kiváltása Társadalmi megítélés, az igény egyre nő Szervezeti fellépések Törvényi szabályozás Költségek, ellenőrzés 2013. 03.11-étől Európai Unió megtiltotta a kozmetikai ipar számára folytatott állatkísérletek végzését SEURAT-1 (50 millió €)

In vitro modellek előnyei Csak a vizsgált mechanizmusra fókuszálnak Egyszerűbb kezelni, kisebb a kockázat, felelősség Sokszor szükségesek a publikáláshoz Időmegtakarítás, elemszám Hátrányok Nem feltétlenül költséghatékonyabb Nem igazán életszerű Sejttenyészet: fertőződés (mycoplasma) Krónikus, szisztémás reakciók vizsgálatára nem alkalmas

A 3 R: Replacement Reduction Refinement Russell and Burch RDS Paget Lecture Date printed: 4/5/2017 A 3 R: Russell and Burch Replacement Reduction Refinement Lecture Date: 21st November 2001

A helyettesítés egyre hatékonyabb RDS Paget Lecture A helyettesítés egyre hatékonyabb Date printed: 4/5/2017 Lecture Date: 21st November 2001

Lehetőségek élő állatmodellek helyettesítésére Csak kémiai komponensek Szöveti homogenizátum, izolált organellum Ex vivo kísérletek Sejt-és szövetkultúrák Mesterségesen növesztett szövetek, szervek Invazív beavatkozás helyett kezelés Lehetőségek élő állatmodellek helyettesítésére

Biokémiai tesztek Immunkémiai technikák (bakteriális toxinok azonosítására) Szerv, szövet vagy sejtkultúrák (biokémiai kutatások céljára) Mikroorganizmusok (karcinogén ill. mutagén anyagok tesztelésére) Magasabbrendű növények Néhány metazoa parazita Komputer szimulációs modellek

Sejttenyésztés 1907 óta létező technika ’50-es évektől kezdve elterjedt eljárás Áttörések: antibiotikumok, médium, tripszin Társaságok, sejt-és szövetbankok Izolált-és mai napig fenntartott sejtvonalak (HeLa) Tenyésztő eszközök rohamos fejlődése (gyógyszergyártás) Gén-és biotechnológia alappillére (klónozás) Rákkutatás (nanotechnológia) Őssejt-és génterápia (etikai kérdések) Szintetikus biológia (mesterséges szervek, programozott sejtek) Virológia (vakcinák készítése)

Vizsgálati lehetőségek Az adott sejt életfolyamatainak nyomonkövetése (sejtanalízis) sejt-sejt kölcsönhatások, a sejtkommunikáció vizsgálata (neuronok) a sejtek különböző kémiai anyagokra adott válaszának analízise (gyógyszerfejlesztés) különböző sejteredetű fehérje termékek előállítására (biotechnológiai ipar) “tissue engineering” céljára Sejttenyészetek eredete: szöveti explantok ("explant kultúrák") sejtszuszpenzió ("szuszpenziós kultúrák")

Sejttenyészetek típusai Primer tenyészetek: embrionális ill. felnőtt szövetből korlátozott ideig tarthatók fenn élettartamuk véges (hetek, néhány hónap) előnyük: a sejtek nem tekinthetők módosított ill transzformált sejteknek, mivel a tenyésztés kezdő lépéseként alkalmazott enzimatikus, vagy mechanikus disszociáción kívül a sejteket más hatás nem éri. hátrányuk: a kultúrák korlátozott élettartama minden egyes preparátum kicsit eltér egymástól, teljesen homogén idegen sejtet nem tartalmazó tiszta tenyészetről nem beszélhetünk. Sejtvonalak: abnormális, gyakran transzformált sejtek homogén sejtpopuláció élettartamuk korlátlan Leggyakrabban rákkutatási célok Könnyebb velük dolgozni, már nem kell izolálni

Ami nélkül nem megy… Laminaris fülke HEPA filter - steril levegő-áramot biztosít Horizontális A levegő horizontálisan, a tenyésztő irányába áramlik veszélyes anyagokkal való munkára nem alkalmas Vertikális A levegő felülről lefelé áramlik veszélyes anyagokkal való munkára ez a típus a legalkalmasabb CO2 Inkubátorok (5-10 %, 100%-os páratartalom) Fáziskontraszttal ellátott invert mikroszkóp

Ablaktalan, fertőtlenített helység (meszelés) Steril öltözet UV-védelem Speciális tenyésztőedények Saját eszközök Vízfürdő, hűtőszekrény 70%-os alkohol Dezinficiens Speciális tápfolyadék (médium) Ionikus homeosztázis Vitaminok, kofaktorok, fémek Fehérjék, lipidek Energia Szérum Bakteriocid-fungicid koktél

A tenyésztőedények felületének kezelésére használjuk: Kollagen (kötőszöveti fehérje) Fibronectinek (sejtfelszíni és plazma fehérjék) Laminin (heteromer glycoprotein) Poly L-lysine (erősen pozitív töltésű polikationos polimer) Poly-L-Ornithin (polikationos poliaminosav) A tenyésztést segítő, a sejttenyésztő oldatokhoz adott szuplementumok: Foetal bovine vagy calf serum Növekedési faktorok Insulin

Alkalmas sejttípusok Általában bármilyen sejt, a legmacerásabbak az izom-és idegsejtek Vérsejtek: a keringési rsz.-be kerülve már nem osztódnak, rövid élettartam Fibroblaszt (kötőszövet): jól szaporodnak, generációs idejük rövid,gyorsan nőnek Epithel (hám): egyszerű dolgozni velük, gyorsan nőnek Embrionális sejtek: jól szaporodnak, kényesebbek Sejtvonalak: már régóta fenntartott sejtek, rengeteg információ, már izolált sejtek (HeLa, HEK, CHO)

Sejtkultúra előállítása Izolálás: szerv kiválasztása sejtciklus, sejtorganellum, sejtkapcsolatok, mozgás alapján, esetleg anyagi és metodikai korlát miatt Konkrét állatmodell mellé in vitro bizonyítékok neonatalis v. adult sejtek,embrionális sejtek, esetleg hibridómák, transzformált sejtek Kezdeti sejtszám, életképesség ideje, növekedés üteme különböző A felnőtt sejtek csak adherens módon képesek növekedni: laminin, vagy kollagén plate, coated-plate (akár recept alapján)

Szövetek szétválasztása sejtekké: emésztőenzimekkel vagy mechanikusan (hőfok, időtartam!), nyírőerő minimalizálása (potter) Mosás, szűrés Sejtek médiumba ágyazása, kezelése Sejtnövesztés inkubátorban Sejtszámolás időről-időre (ePetri) Minden típus esetén szükséges a rendszer ki-titrálása Kevert kultúrák esetén figyelem a fibroblasztokra Passzálás Viabilitási-tesztek Proteomika, fagyasztás-felengedés (DMSO!)

A sejttenyésztő rémálma… Befertőződés Kémiai anyagok által (lejárt médium) Biológiai ágensek: baktériumok, gomba (mycoplasma-tesztek, alkohol, szájmaszk) Médiumban indikátor: fenolvörös: metabolikus aktivitást jelez a pH változása Fertőzésgyanúnál ki kell dobni a rendszert és mikrobiológiai vizsgálatot kérni Újra kell fertőtleníteni a helyiséget és az eszközöket Autokláv, inkubátor vízcseréje, alkohol Félévente speciális takarítás ajánlott

Szövettenyésztés Sejtek szövetekként történő növesztése egy speciális vázon (scaffold) Célja: pótolni a többé már nem funkcióképes szöveteket, javítani az adott szerv funkcióját Regeneratív medicína-szintetikus biológia-őssejt terápia Fontos az immunrendszer válaszának minimalizálása (graft vs. host) így a legjobbak az autológ sejtek Alkalmaznak allogén sejteket is (immunszupresszió, MHC mutációk) Xenogén sejtek (sertés, anti-inflammációs gének KI- a jövő útja?)

Scaffold Hálózatos polymer, különböző anyagokból készülhet (protein, poliszacharid, polipeptid) Lehetővé teszi a sejtek számára a növekedést, átjárható a tápanyagok számára, ECM képes rajta létrejönni Meg kell tartania a szövet eredeti 3D-s struktúráját Biztosítania kell a sejtek számára megfelelő mikrokörnyezetet Megengedi a sejtek migrációját

Egy ideális scaffold… 3D Keresztkötéseket tartalmaz Pórusokat tartalmaz Biológiailag lebontható Megfelelő kémiai körülmények uralkodnak a felszínén Bírja a mechanikai terhelést Biokompatibilis Elősegíti a természetes gyógyulási folyamatokat Hozzáférhető Nagyüzemben gyártható

Leggyakoribb típusok Polymerek Kristályos anyagok Kollagén Laminin Fibrin Decellularized matrix (szív) Kristályos anyagok Hydroxyapatite Kálcium-foszfát Bioglass

Elkopott porcok helyettesítése Porcsejtek Kollagén váz Nem igényel kiterjedt érhálózatot

Csontnövesztés Őssejtek csontsejtekké történő differenciálódásával A parancs növekedési faktor függő Nem szabad túl nagynak lennie a váznak, különben a sejtek nem kapnak elég oxigént 3D Calcium- scaffold

Bőrnövesztés Kollagén-kitozán, vagy hialuronsav scaffold Egyszerre egyféle sejt, 3 sejtréteg Égési sérülteknél siker

Cukorbetegek ß-sejtjeinek pótlása In vivo Islet of Langerhans in pancreas

Mesterséges véredények By-pass műtéteknél használatos http://popularmechanics.com/popmech/sci/tech/9805TUMDOM.html

Szív regenerációja Szívizomsejt, véredények Felnőtt szívizomsejtek tenyésztése nehézkes Természetes scaffold (decellularized matrix) Sokféle sejttípus, bonyolult terület

Lehetőségek májbetegeknek

Bioprinting Feltaláló: Forgách Gábor (Missouri Egyetem) Hidro-gél alapú vázra élő sejtek felvitele Tintasugaras nyomtatófej juttatja rá a sejteket, több rétegben, körben is (3D) 2 nyomtatófejet használ: sejtek nyomtatása+gélszerű, tápanyagokban gazdag médium adagolása Kalibráció: lézerrel történik, szoftver irányít Véredények by-pass műtétekhez Távolabbi célok : teljes szervek nyomtatása, bőrpótlás, mint rutin kezelés

Köszönöm a figyelmet!!!