A DNS szerkezete és replikációja

Mit kell „tudnia” a genetikai anyagnak? 1. Rendelkeznie kell az információ tárolásának képességével. Tehát kémiailag elegendően stabilnak kell lennie és valamilyen módon képesnek kell lennie adatok tárolására, amelyek kiolvashatók belőle. 2. Alkalmasnak kell lennie arra, hogy a sejt ezen információt pontosan meg tudja kétszerezni és tovább tuja adni az osztódások során. 3. Képesnek kell lenni az állandóság mellett változásra is. A változás mértéke azonban nem lehet túl nagy (nem lenne öröklődés), de nem lehet nulla, mert akkor nem lenne evolúció. A DNS 1900-as évek elején ismert kémiai szerkezete (4-féle szerves bázis, foszforsav és dezoxi-ribóz) túlságosan egyszerű felépítésűnek tűnt ahhoz, hogy a fenti feladatoknak megfelelhessen. Sokkal alkalmasabbnak tűntek a fehérjék (20-féle aminosav építi fel).

A baktérium transzformáció felfedezése Frederick Griffith kísérlete 1928. R törzs S törzs A Streptococcus pneumoniae (tüdőgyulladást okozó bakt.) virulens, S (tokképző) törzsével beoltott egerek tüdőgyulladásban elpusztulnak, az avirulens, R (tokot nem képző) törzzsel beoltottak túlélnek. Az S törzs baktériumai tokot választanak ki, ami megvédi őket az immunrendszeről.

A baktérium transzformáció felfedezése Griffith kísérlete 1928. A hővel elölt S baktériumok és az élő nem-virulens R baktériumok keverékével beoltott egerek elpusztulnak. A hővel kezelt S törzs nem pusztítja el az egereket. Az utolsó kísérlet döglött egereiből élő S baktériumok tenyészthetők ki. Az elölt baktériumok anyagából valami az R baktériumokat S-é alakította át (transzformálta).

Az S törzs elölt baktériumaiból kiszabadult anyagot felvették az R törzs sejtjei és ezáltal megváltozott a természetük: maguk is tok termelésre váltak képessé, átalakultak, transzformálódtak. Kérdés, hogy mi lehet az az anyag, amely a transzformációt okozza?

A genetikai anyag a DNS Sokáig úgy gondolták, hogy a transzformáló anyag a fehérje, csak 1944-ben igazolták először, hogy a genetikai anyag a DNS. O. Avery (és C.M. Mac Leod és M. McCarty) kísérlete, 1944. A DNS a transzformáló anyag. Az S sejtekből kivont anyagokból egyedül a DNS az, amivel az R sejtek S formává alakíthatók. A transzformáló anyagot nem lehetett elbontani proteázokkal, szénhidrát és zsírontó enzimekkel, de hatástalanná vált nukleázok alkalmazása esetén. Csak a tisztított DNS képes a baktériumokat transzformálni. A DNS transzformáló képessége igazolta először, hogy a gének DNS-ből állnak.

A Hershey-Chase kísérlet bakteriofágokkal (1952) A radioaktivitás a leváló üres fág fejekben észlelhető. jelölt fehérje elválasztás A radioaktivitás a baktériumokban észlelhető, majd a következő fág generációban is megjelenik. jelölt DNS elválasztás A Hershey-Chase kísérlet igazolta, hogy a fágok örökítő anyaga a DNS nem pedig a fehérje. A kísérlet kétféleképpen előkészített T2 fágot használt. Az egyik esetén a fehérje burkot radioaktív kénnel (35S) jelölték, mert a kén nem fordul elő a DNS-ben. A másik esetben radioaktív foszforral (32P) a DNS-t jelölték, mert a foszfor nem fordul elő a fehérjében. Csak a 35P injektálódott az baktériumba, jelezve, hogy a DNS az a szükséges anyag, ami az új fágok létrejöttéhez szükséges.

A DNS kémiai összetevői A DNS kémiai felépítésének alapegysége a nukleotid (nukleozid-monofoszfát). A DNS ezek polimerje – polinukleotid (hasonlóan az RNS-hez). A nukleotid foszforsavat (foszfátot), de(z)oxiribóz cukrot és négyféle N tartalmú heterociklusos szerves bázisból egyet tartalmaz. A négy bázis az adenin (A), a guanin (G), a citozin (C) és a timin (T). Ezek közül az A és G purinvázas, nagy méretű, a C és T pirimidinvázas, kis méretű bázisok. A nukleotidok teljes kémiai neve: rövidítése dezoxiadenozin-5’-monofoszfát, dAMP - A dezoxiguanozin-5’-monofoszfát, dGMP - G dezoxicitidin-5’-monofoszfát, dCMP - C dezoxitimidin-5’-monofoszfát, dTMP - T

A nukleinsav bázisok és cukrok nagy, purin bázisok kicsi, pirimidin bázisok A nukleinsav bázisok és cukrok A nukleinsavak viszonylag egyszerű felépítésű makro-molekulák, amelyekben öt- féle szerves bázis fordul elő. A DNS-ben lévő cukor egy aldopentóz, a dezoxiribóz C5H10O4 (az RNS-ben a ribóz C5H10O5). A DNS-ben lévő cukornak nincs szabad hidroxil csoportja, ami növeli a DNS kémiai stabilitását. A bázisok közül négy csak a DNS-ben, négy csak az RNS-ben fordul elő. DNS: ATCG RNS: AUCG A szeves bázisok oxo-enol átalakuláson mehetnek keresztül és hidrogén kötések kialakítására képes csoportjaik vannak.

A DNS kémiai összetevői

Nukleotid szerkezete 3’ C atom – ezzel kapcsolódik a polinukleotid lánc következő nukleotidjának foszforsav részéhez N tartalmú, heterociklusos szerves bázis (adenin) Foszforsav rész (foszfát csoport) Cukor – aldopentóz (ribóz) 1’ C atom (glikozidos OH csop.) – bázis kapcsolódási helye 5’ C atom – a foszforsav rész kapcsolódási helye 2’ C atom – ezen nincs O a DNS-ben

A Chargaff szabályok Kölönböző élőlényekből kivonható DNS összetételének vizsgálata érdekes törvényszerűségeket tárt fel. A törvényszerűségeket Erwin Chargaff ismerte fel: Az élőlényekből származó DNS-ekben a pirimidin nukleotidok (T + C) mennyisége egyenlő a purin (A + G) nukleotidok mennyiségével. A T mennyisége egyenlő az A-val, és C mennyisége egyenlő G-vel. Az A + T és C + G mennyiségek nem egyenlők, azok aránya jellemző az élőlényre amiből a DNS származik.

A DNS röntgen diffrakciós képe (R.Franklin és M.Wilkins 1953) A röntgen diffrakcióval kapott adatok azt jelezték, hogy - a molekula fonálszerű, - a fonál két párhuzamos szerkezetből áll. - egyenletes átmérőjű, - spirál alakú.

A DNS térszerkezetét Watson és Crick oldotta meg l953-ban. A modell kidolgozása során összeillesztették a röntgen diffrakciós adatokat, a Chragaff szabályokat és a DNS és alkotórészeiről felhalmozódott kémiai ismereteket olymódon, hogy a modell eleget tehessen az örökítő anyag által támasztott követelményeknek.

H-hidakkal kapcsolódó komplementer bázispárok A kettős spirál szalag modellje A kettős spirál egyszerűsített képe. A pálcák a bázispárokat képviselik. A szalagok a két antiparallel lánc cukorfoszfát gerincét képviselik. A méretek angström-ben (1Å = 0,1 nm) mutatják a távolságokat. A spirál 10 bázisonként fordul csaknem pontosan 360o-ot. Cukor-foszfát lánc H-hidakkal kapcsolódó komplementer bázispárok

A kettős spirál jellemzői A nukleotidok szabályosan ismétlődő távolságokban egymás felett helyezkednek el. A nukleotidok lapos molekuláinak síkja merőleges a szál hossztengelyére. A DNS tér-modell két ellentétes lefutású, u.n. antiparallel szálból épül. A modell egyenletes átmérője a Chargaff szabályok követésével biztosítható úgy, hogy purin bázissal pirimidin bázis áll szemben. Ezeket egymáshoz hidrogén hidak rögzítik.

A kettős spirál kémiai szerkezete A modellben a vízben kevéssé oldódó (kevésbé poláros, hidrofób) bázisok belül, a vízben jól oldódó (erősen poláros és ionos, hidrofil) cukor és foszfát csoportok kívül helyezkednek el. A molekula gerincét alkotó láncban a foszforsav észter kötéssel (csoporttal) kapcsolódik a cukrok 3’ és 5’ szénatomjához. Minden bázispár egy purin (A vagy G) és egy pirimidin bázist (T vagy C) tartalmaz. Az A-T párt 2, a G-C párt 3 hidrogénhíd kapcsolja össze. A két lánc egymás komplementere. Az antiparallel irányultságot a cukor-foszfát lánc ellentétes 5’-3’ iránya adja. A cukor foszfát lánc igen rugalmas, a hajlítást, csavarást igen jól tűri. 5’ 3’ 3’ 5’

A bázis párosodás módja A négy lehetséges purin-pirimidin bázispárból (A-T, A-C, G-C, G-T) csak kettő, az A-T és a G-C felel meg Chargaff második szabályának. Watson és Crick kimutatta, hogy csak az A-T és G-C bázispárok képesek hidrogén hidakkal a modellbe beillő módon összekapcsolódni. A modell azt jósolja, hogy a nagy G-C tartalmú DNS stabilabb a nagy A-T tartalmúnál. Ez a jóslat beigazolódott.

A DNS reverzibilis denaturációja A bázisok közötti kölcsönhatás erőssége függ a környezet pH-jától, az ionkoncentrációjától és a hőmérséklettől. Magas hőmérsékleten (vagy nagyon alacsony ionkoncentráció mellett) a DNS-t összetartó erők nem elégségesek a két lánc összetartására, a DNS láncai széttekerednek, a DNS denaturálódik („megolvad”) A denaturáció reverzibilis folyamat (a láncok összeállását molekuláris hibridizációnak nevezzük)

A DNS megkettőződés (replikáció) A DNS kettős spirál szerkezetéből közvetlenül adódik a megkettőződés mikéntje. A bázis párosodás szigorú törvényéből az következik, hogy amennyiben a kettős spirál két szála a H-kötések mentén kettéválik, mindkét szál mintaként (templátként) szolgálhat egy új szál szintéziséhez, melynek során az eredeti szállal és egymással megegyező szerkezetek jönnek létre. Ezzel magyarázatot nyer a mitózis jelensége, az örökítőanyag pontos átadása. A genetikailag kódolt információt a nukleotidok sorrend adja.

A DNS elméletileg lehetséges replikációs módjai szemikonzervatív konzervatív* diszpezív* A régi szál sötét színű, az újonnan szintetizált világos. *nem tananyag

A Meselson-Stahl kísérlet (1958)* A több generáción keresztül 15N táptalajon tartott baktériumokból származó DNS nehéz sávot ad centrifugálással. A normál (14N) táptalajon nevelt baktériumok DNS-e pedig könnyű sávot. Ha a 15N-en tartott sejteket átteszik könnyű táptalajra, az első nemzedékben köztes, a második után könnyű és köztes sáv figyelhető meg. *nem tananyag

A Meselson-Stahl kísérlet értelmezése* A Meselson-Stahl kísérletben kapott eredmények csak a szemikonzervatív DNS replikációval értelmezhetők : Az első nemzedékben egyetlen sáv, a második nemzedékben egy köztes és egy könnyű sáv. *nem tananyag

Vezető szál, elmaradó szál* régi szál vezető szál elmaradó szál a villa mozgása Az elmaradó szál szintézise: RNS primer új DNS Okazaki fragment ligálás 1., 2., 3., 4., A vezető szál szintézise folytonos. Az elmaradó szálon: 1., A primáz RNS-t szintetizál. 2., A DNS polimeráz III DNS-t szintetizál a primer folytatásaként. 3., A DNS polimeráz I eltávolítja az előtte lévő RNS darabot és befejezi a láncot. 4., A DNS ligáz összekapcsolja a különálló DNS darabokat. *nem tananyag

A DNS replikáció enzimei* topoizomeráz A topoizomeráz a szál kitekerése hatására a villa túloldalán felhalmozódó torziós feszültséget (csavarodást) csökkenti olymódon, hogy az egyik szálat elvágja, azt a másik szál körül „kipörgeti”, majd a vágást összekapcsolja. *nem tananyag