IMMUNKOMPLEXEK KIALAKULÁSA, SZEROLÓGIAI REAKCIÓK (KOMPLEMENT MEDIÁLT LÍZIS, PRECIPITÁCIÓ, AGGLUTINÁCIÓ) (Az Ag-Ea kölcsönhatást követő másodlagos szerológiai reakciók)

C3 KONVERTÁZ C3b Antigén-ellenanyag komplex Mannóz Patogén felszín MBL MASP-1/MASP-2 Szerin proteáz C4, C2 C3 B, D C1q, C1r, C1s Szerin proteáz C4, C2 C3 KONVERTÁZ C4a* C3a, C5a C3b TerminálisC5b – C9 Opszonizáció Kötődik a fagocita CR-hoz Immunkomplex eltávolítás Gyulladásos mediátorok Fagocita toborzás MAC Patogén/sejt lízis

Szérum komplement aktivitás titrálása Y komplement fehérjék a humán szérumban növekvő mennyiségű humán szérum Szérum komplement aktivitás titrálása hemolízis

Hemolízis (ozmolízis) KONTROLL KÍSÉRLETEK fiziológiás sóoldat desztillált víz hőinaktivált humán szérum Y Y Y Negatív kontroll Pozitív kontroll Hemolízis (ozmolízis) Ülepedés Ülepedés

KOMPLEMENT KIMERÍTÉS Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y 1 2 a humán szérumban BSA anti-BSA ellenanyag csökkenő mennyiségű anti-BSA ellenanyag Y Y 1 2 felülúszó Y Y Y Y Y Y Y felülúszó felülúszó növekvő mennyiségű felülúszó növekvő mennyiségű felülúszó növekvő mennyiségű felülúszó

Az antigénnek az ellenanyaggal alkotott (oldható) komplexei. IMMUNKOMPLEX Az antigénnek az ellenanyaggal alkotott (oldható) komplexei. A komplexképződés pillanatszerűen is lejátszódhat, egyensúlyra vezető folyamat. Nem azonos a precipitátummal! A precipitátum az immunkomplexekből fizikai-kémiai folyamatok során keletkező oldhatatlan csapadékot jelenti. Időigényes folyamat.

Precipitációs görbe EKVIVALENCIA ellenanyagtúlsúly antigéntúlsúly sok csapadék kevés csapadék növekvő antigén mennyiség ellenanyagtúlsúly sok csapadék antigéntúlsúly kevés csapadék növekvő ellenanyag mennyiség

- valencia hőmérséklet pH sókoncentráció idő egyéb (pl. PEG) Ekvivalenciát befolyásoló tényezők: - valencia (kapcsolatteremtő képesség) hőmérséklet (37оC ; 4 оC ) pH sókoncentráció idő egyéb (pl. PEG) IgM-pentamer IgA-dimer Oldékonyságot csökkenti, kedvez a csapadék-képződésnek

MÓDSZEREK Immundiffúzió: (lágy gélközegben) - radiális egyszerű (ellenanyagot vagy antigént keverik a gélbe) - radiális kettős (mindkét komponens diffundál a gélben) Elektroforézis: - immunoelektroforézis (többkomponensű antigént elektroforetizálják, majd polivalens ellenszérummal reagáltatják.) - rakéta elektroforézis (ellenanyagot gélbe keverik, antigént elektroforetizálják) - két-dimenziós elektroforézis (elektroforetikus tulajdonságok alapján szétválasztott antigén frakciókat ellenanyag tartalmú gélen újra Turbidimetria (a fényszórással arányos fényintenzitás csökkenését méri) Nefelometria (a szórt fény intenzitását méri)

Immundiffúziós módszerek Radiális kettős immundiffúzió Ouchterlony módszer Mancini módszer jobb oldali 3 ábra: fent: 1 és 1 antigén azonos középen: 1,2,3 különböző antigének alul: 1 és 2 részben azonos, de a 2-n van legalább egy olyan epitop ami az 1-en nincs (ezért a „sarkantyú”) Radiális kettős immundiffúzió Extrahálható nukleáris anitgén (ENA) specifikus antitestek kimutatása (Ro, La, Sm, RNP, Scl-70, Jo1) Antigének közös determinánsainak vizsgálata

Antigén koncentráció meghatározása radiális immundiffúzióval IgG koncentráció mérése szérumból radiális immundiffúzióval. A standardok átmérője lehetővé teszi a kalibrációs görbe megrajzolását. A vizsgált szérum minta IgG koncentrációja a görbéről leolvasható: - T1 – IgG mielómás beteg szérumából; 15 mg/ml - T2 – hipogammaglobulinémiás beteg széruma; 2,6 mg/ml - T3 – normál szérum; 9,6 mg/ml A gyűrű átmérője IgG koncentráció (mg/ml) Radiális immundiffúzió: az antigén koncentráció és a precipitációs gyűrű méretének kapcsolata. A nagyobb koncentrációjú antigén a lyuktól messzebbre vándorolva éri el azt az egyensúlyi állapotot, ahol a megfelelő ellenanyag-mennyiséggel precipitátumot képez. Ea a gélben A gyűrű átmérője Ag koncentráció

Immunelektroforézis Immunprecipitáció - + Az antigén-ellenanyag kapcsolódást követően képződő oldott immunkomplexeket szilárd fázishoz kötött anti- immunglobulin vagy protein A/G bakteriális fehérjék segítségével oldhatatlan formában izolálják. A szilárd fázishoz kötött immunkomplexek további elúciós lépések eredményeként, oldott állapotban visszanyerhetők. (lásd a következő szemináriumon/gyakorlaton)

Rakétaelektroforézis Az automaták felváltották ezt a módszert. A rakéta alakú precipitációs csúcsok magassága arányos az antigén koncentrációjával

Szerológiai módszerek alkalmazása Immundiffúzió: pl: bakteriális, virális és gomba antigének jellemzésére - radiális egyszerű (Mancini-módszer): antigének mennyiségének összehasonlító vizsgálata, szérum fehérjék (immunoglobulin izotípusok [IgM, IgG, IgA], akut fázis fehérjék, transzferrin, komplement komponensek) mennyiségi meghatározása különböző testfolyadékokban, ellenanyagok mennyiségi meghatározása - radiális kettős (Ouchterlony-módszer): precipitációs ekvivalencia zóna becslése, precipitáló ellenanyagok relatív szintjének (titerének) meghatározása, állandó ellenanyag koncentráció mellett az antigén mennyisége is megbecsülhető Elektroforézis: - immunoelektroforézis: szérum fehérjék frakciókra való elválasztása, plazmasejt diszkráziák (mielóma multiplex, Waldenström makroglobulinémia, elsődleges amiloidózis) során képződő, monoklonális eredetű immunoglobulinok kimutatása - rakéta elektroforézis: antigén/ellenanyag koncentráció meghatározása - két-dimenziós elektroforézis: elektroforetikus mobilitás alapján szétválasztott frakciók koncentrációjának meghatározása; szérum, vizelet, cerebrospinális folyadék fehérjeösszetételének kvantitatív és kvalitatív vizsgálata Turbidimetria: (érzékenység: 50 µg/ml) szérumban, liquorban nagy mennyiségben jelen lévő fehérjék vizsgálata Nefelometria: (érzékenység: 1 µg/ml) kis koncentrációjú szérum és liquor fehérjék, gyógyszer szintek mérése

Agglutináció típusai, gyakorlati alkalmazás A vörös- és fehérvérsejtek valamint baktériumok sejtfelszíni antigénjeivel (legalább mikroszkópikus méretű antigének) reagáló ellenanyagok a sejtek összeállását, agglutinációját idézhetik elő. Fajtái: direkt: Ellenanyagok kötődését az antigénhez a sejtek összecsapódása kíséri (pl. AB0 vércsoport antigének) - főleg IgM indirekt : Az antigén determinánsok elrendeződése nem teszi lehetővé az direkt összecsapódást. DE! A sejtek összecsapódása a kötött ellenanyagok Fc részéhez kötődő második ellenanyaggal kiváltható (pl. D vércsoport antigén (Rh)) - főleg IgG passzív: Megfelelően kezelt vörösvértestekhez vagy latex részecskékhez haptének vagy antigének kapcsolhatók, és ezekre specifikus ellenanyaggal agglutinálhatók rheumatiod arthritis: A szérumban a saját IgG-vel reagáló IgM és IgG autoellenanyagok (RF= rheuma faktor) jelennek meg.

- reakció - reakció + reakció gyors ülepedés lassú ülepedés

Direkt agglutináció vörös-vértest pl. AB0 vércsoport meghatározás

Az ABO vércsoportantigének szerkezete O ANTIGÉN A ANTIGÉN B ANTIGÉN SZÉNHIDRÁT TÍPUSÚ ANTIGÉNEK A fenotípusok kialakulását kodominánsan öröklődő specifikus enzimek irányítják.

Donorválasztás az ABO-vércsoport antigének alapján Ma már csak elvi lehetőség, rutinban kizárólag csoportazonos (AB0 és Rh) vér transzfundálható!

Vércsoport meghatározás Ágy melletti gyorsteszt Microplate-s meghatározás Hagyományos csempés meghatározás Gélkártyás technika

Kvantitatív hemagglutinációs teszt Egy adott antigénre specifikus antitestek számának (antitest titer) meghatározása. Az antigén lehet a vvt. vagy a baktérium felszínén.

Indirekt agglutináció primer AT szekunder AT pl. Rh vércsoport meghatározás 23

A Rhesus (Rh) vércsoportantigén (D) FEHÉRJE ANTIGÉN extracelluláris tér citoplazmamembrán intracelluláris tér IgG típusú ellenanyag direkt agglutinációt nem vált ki (inkomplett ellenanyag), de emberi immunglobulinokkal reagáló 2. ellenanyaggal az agglutináció kiváltható indirekt agglutináció

Az agglutináció in vivo következményei ABO inkompatibilitás intravascularis haemolysis (komplement mediálta hemolízis) Rh inkompatibilitás erythroblastosis fetalis (vvt-ek opszonizálása, majd MF-ok, granulociták általi fagocitózis) Rh profilaxis Ha az első Rh+ magzat születését követően 72 órán belül az anyai szervezetbe anti-D Ea-t juttatnak, megelőzhető az anyai ellenanyagok képződése.

Erythroblastosis foetalis Vérképzés a tüdőben Erythroblastok a csontvelőben Erythroblastosis foetalis Hemolysis Sárgaság Anémia Erythroblast szám Hepatosplenomegália Sápadtság Ödéma Szívelégtelenség

Újszülöttek hemolítikus anémiája Miért nem alakul ki az első Rh+ magzattal szemben immunreakció? - Mert csak a szülés kapcsán kerül elegendő antigénstimulust jelentő vvt az anyai keringésbe. (Immunogenitást meghatározó tényező az antigén mennyisége!) Van-e kivétel az előző szabály alól, miért van/nincs? - 20. hét utáni vetélés, amniocentesis, transplacentaris vérzéssel járó más szülészeti beavatkozás, ok: ld. előző magyarázat! Miért adunk anti-D IgG-t profilaktikusan? - Mert a bekerülő Rh+ vörösvértesteket azonnal eliminálja, mintegy „elrejti” az anyai immunrendszer elől. Miért véd az AB0-inkompatibilitás az Rh-inkompatibilitás következményeitől? - Mert az anti-A és anti-B ellenanyagok természetesen is állandóan jelen vannak (ezen antigének pl. a érendothelen, a bélbaktériumokon is kifejeződnek), és azonnal eliminálják az inkompatibilis vörösvértesteket. (maszkírozás, ld. előző magyarázat!) Miért ritkább az AB0-inkompatibilitásból eredő hemolítikus betegség? - Mert az AB0-antigének szénhidrátok, IgM izotípusú ellenanyagok termelődnek ellenük. Az IgM ellenanyagok nem jutnak át a placentán.

(diagnosztikai/indikátor módszer) Passzív agglutináció (diagnosztikai/indikátor módszer) Rheumatoid arthiritis: a szérumban a saját IgG-vel reagáló IgM autoellenanyagok (RF = reuma faktor) jelennek meg. Humán immunglobulin antigéneket fixálva latex gyöngyök / vvt-k felszínére és ezeket az RA-s beteg szérumával reagáltatva agglutináció következik be, ha a szérumban RF van jelen.

Passzív hemagglutináció gátlása oldott Ag-nel Szerintem ezt sehol máshol nem ismerik csak itt a szemináriumon Oldott haptén vagy Ag gátolja az agglutinációt. pl. Monoteszt terhességi teszt: vvt-k felszínéhez hCG-t kapcsolnak és hormon specifikus ellenanyaggal váltják ki az agglutinációt. Ha ehhez a rendszerhez terhes nő vizeletét adjuk (oldott hCG!), akkor gátoljuk az agglutinációt.

Hemagglutináció ellenanyagok jelenléte nélkül? (Nem immunológiai reakció!!!) Igen, virális fehérjékkel pl.: influenza, mumpsz pl. vírus ellenes ellenanyagok kimutatása Az agglutinációt gátló ellenanyagok a receptor kötést (sziálsav) is gátolják, tehát vírusneutralizáló sajátságúak

Gyakorlati alkalmazás direkt agglutináció: ABO vércsoport meghatározás Widal-teszt: tiphoid láz, febris undulans indirekt agglutináció: anti-D Ea jelenlétének kimutatása direkt Coombs-teszt: vércsop. inkompatibilitás, autoimmun hemolitikus anémia indirekt Coombs-teszt: transzfúzió előtt, terhesség alatt passzív agglutináció: rheuma faktor kimutatása terhességi monoteszt Tiphoid láz: tífusz, paratífusz (Salmonellosis) Febris undulans: Brucellosis

Az immunoesszék érzékenysége