Immunrendszer sejtjeinek jellemzése és elválasztása Áramlási citometria, FACS Az immunrendszer sejtjeinek funkcionális vizsgálata (1.): poliklonális limfocita aktiválás

Az immunoesszék érzékenysége

Az immunrendszer sok sejttípusa (pl Az immunrendszer sok sejttípusa (pl. a különféle limfociták) morfológiailag nem megkülönböztethetők egymástól

HUMÁN LIMFOCITAPOPULÁCIÓK FONTOSABB SEJTFELSZÍNI STRUKTÚRÁI („antigénjei”)

Az immunrendszer sejtjeinek jellemzése sejtfelszíni antigének Az immunrendszer sejtjeinek jellemzése sejtfelszíni antigének*/markerek alapján A sejtfelszíni markerek alapján jellemezhető a sejtek funkcionális állapota is (nyugvó/aktivált) és diagnosztikus értéke is lehet a sejttípusok jellemző százalékos arányának megváltozása, rendellenes sejtfelszíni markerek megjelenése, egyes markerek mennyiségének megváltozása, eltűnése esetén. Példák: „Aktiválási markerek” megjelenése (CD69 (limfociták), CD83 (DC)) haematológia neoplasticus folyamatok diagnosztikája, csontvelői érési zavarok HIV progresszió/AIDS manifesztációja: CD4+ helper T sejtek számának csökkenése (CD4+ : CD8+ = 1.6, Normál CD4+ T-sejt szám = 600 – 1400/l) AIDS = CD4+ T sejt szám <200/l! CD5+ B sejtek felszaporodása – B sejtes leukémiák egy része (* az immuniológusok gyakran az immunválasz szemszögéből viszonyulnak különféle anyagokhoz, ezért gyakran megesik, hogy ott ahol mások a „molekula”, „receptor” vagy „fehérje” kifejezéseket használnák ott az „antigén” szót találjuk. Mivel ezeket az anyagokat gyakran ellenanyagok segítségével fedezték fel/mutatják ki, a terminus használata helyénvaló)

CD antigén sejttípus funkció ligand T sejtek T sejt antigén receptor jelátvivő része (Intracelluláris kináz, foszfatáz) CD4 helper T sejtek, plazmacitoid dend-ritikus sejtek (pDC), monociták T sejt antigénreceptor koreceptora, (HIV receptor) MHC-II, HIV CD5 T sejtek, (B sejt alpopuláció: B1) sejt adhézió, jelátvitel (kostimuláció) CD72 CD8 citotoxikus T sejtek, (NK,  T sejtek) T sejt antigénreceptor koreceptora MHC I CD14 Monociták, makrofágok, granulociták egy része LPS receptor része LPS, LBP CD19 B sejtek CR2 része, B sejt antigénreceptor koreceptora C3d, C3b CD28 kostimuláció (B7-1, B7-2) CD80, CD86 CD34 hematopoietikus progenitor sejt, endotélium sejt adhézió CD62L (L-szelektin) CD56 NK sejtek, (T és B sejt alpopuláció) homoadhézió (N-CAM izoform) CD80, CD86 (B7-1, -2) professzionális APC: DC, B, monocita, makrofág kostimuláció, sejt adhézió CD28, CD152 A megbeszéltek vannak megemlítve és egy két olyan ami említésre kerül ebben az anyagban. LPS – lipopoliszaharid LBP – lipopoliszacharid kötő fehérje CR2 – komplement receptor 2 (liganduma: C3d és C3b) (A C3d a C3b-ből keletkező fragment. Nem enzimaktív, de az opszonizáláshoz jobb mint az eredeti)

Rendkívül nagy számú sejt egyedi vizsgálatára alkalmas Áramlási/áramlásos citometria Az immunofluoreszcens módszerek közé tartozik, a felhasználás lehetőségek jelentős része a monoklonális technikán alapul. Rendkívül nagy számú sejt egyedi vizsgálatára alkalmas Folyékony közegben, nagy sebességgel áramló egyedi sejteket vizsgál A fluoreszcens festékkel jelölt sejtek által kibocsátott fény intenzitását és a sejtek fényszórását detektálja Morfológiai adatokat csak közvetetten szolgáltat (méret, granuláltsági állapot) Statisztikai jellegű módszer FELHASZNÁLÁS: A klinikumban immunológiai és haematológiai diagnosztika, kis százalékban jelenlevő sejtek vizsgálata. A kutatásban széleskörű felhasználás a sejtek életképességének mérésétől a kromószamaanalízisen át a sejtelválasztásig.

Fluoreszcens jelzőanyagok sejtekbe juttathatók, vagy ellenanyagokhoz konjugálhatók Fluoreszcein, FITC (fluoreszcein izotiocianát) Ez két dia arról, hogyan néznek ki ezek az anyagok. Gyorsan át lehet szaladni rajtuk. A bal oldalibb görbe a gerjesztö fényé (kisebb hullámhossz nagyobb energia), a jobb az emisszióé. fluoreszcein-5-izotiocianát Sok izomer létezik, ezek spektrumai kissé eltérhetnek egymástól! 8

Fluoreszcens jelzőanyagok Fikoeritrin, PE (fehérje) Az ábrázolt tetrapirrol lánc a fikoeritrin(PE) kromofór csoportja. A fluoreszcens PE egy fehérje, ezzel a kromofór csoporttal. A bal oldalibb görbe a gerjesztö fényé (kisebb hullámhosszú nagyobb energia), a jobb az emisszióé. 3Z-fikoeritrobilin (PEB) kromofór csoportja A fikoeritrin különféle algák fotoszintetikus apparátusában a klorofill ”alá dolgozó” fehérje 9

Fluoreszcens jelzőanyagok Kívánalmak a festékekkel szemben minél nehezebben kioltható fluoreszcencia (fotostabilitás) minél szűkebb excitációs és emissziós spektrum (több „szín” együttes használhatósága miatt) Új generációs festékek Előnyös kioltási és spektrális tulajdonságok „egzotikus” spektrális tartományok használata: UV (Pacific Blue®), IR (PE-Cy7, APC-Cy7) Tandem festékek: energiaátadás a két komponens között, nagy eltérés lehet az excitációs és emissziós spektrum között (akár extrém „Stokes-shift”-ek is, pl. PE-Cy7) BD Cy-chrome® (PE-Cy5, CyC, PC5) PE-Cy7, PerCP-Cy5.5, APC-Cy7 APC, AlexaFluor® család, Dyomics DY-xxx, Pacific Blue®, TexasRed ®, PE-TexasRed ®

A citométerek fejlődése a korai sejtszámláló berendezésektől a sejtválogató „szorterekig” ©J.Paul Robinson A citométerek fejlődéséről néhány gyorsan végigfutható kép Early cell counter. Katherine Williams and C.S. Sanders (Atomic Energy Research Establishment) 1948 - Unclassified in 1956. (Photo taken in Science Museum, London UK) 11

asztali áramlási citométer (BD FACSCalibur™) Ezt benne lehetne hagyni, hiszen ilyesmikkel találkozhatnak majd Itt is az alsó a mienk (is) szorter-áramlási citométer (FACS, BD FACSDiVa™) 12

A lamináris áramlás lehetővé teszi a sejtek gyors vizsgálatát a: eritrociták a lamináris folyadékáramban egyenletesen rendeződve és kissé elnyúlva haladnak a hirodinamikai erők hatására a központi áramlat mentén b: turbulens áramlásban a sejtek deformálódnak és a cső fala mentén szétszórtan, különböző sebességgel haladnak a folyadékárammal (v>3 m/s) A mérés gyakorlati lehetősége ezeken az elveken alapul. A lamináris áramlás lehetővé teszi az egyes sejtek egymás utáni mérését, még nagy áramlási sebesség esetén is. Turbulens áramlásban a különböző pozíciókban elhelyezkedő sejtek ”össze-vissza” szórják a fényt – használhatatlan. Image fromV. Kachel, et al. 13

(hidrodinamikai fókuszálás) Lamináris áramlásban a tinta vékony sugárba rendeződve áramlik az elvezető csövön keresztül (hidrodinamikai fókuszálás) Lamináris áramlásban a sejtek egy keskeny sávba ”terelődnek”, így az oda fókuszált optikával jól vizsgálhatók/megvilágíthatók. A tinta elvezető-csőbeli elhelyezkedését alig befolyásolja az eredeti pozíciója V. Kachel, H. Fellner-Feldegg & E. Menke 14

A citométer hidrodinamikai rendszere vivő- vagy köppeny folyadék Áramlási cella Injektor Fluoreszcens szignálok Fókuszált lézer sugár vivő folyadék + + + Így valósítják meg a lamináris áramlást a gyakorlatban. A sejteket tartalmazó folyadékot („minta”) enyhe többletnyomás nyomja a köppenyfolyadék áramlásába. minta akár 6-10m/s sebesség 15

Előre irányuló fényszórás A mért paraméterek: Fényszórás (FSC, SSC) Előre irányuló fényszórás Lézer Az előre irányuló fényszórás detektorába a lézer fénye közvetlenül azért nem jut be, mert vagy nem teljesen előtte helyezkedik el, vagy egy kis fémlemez kiárnyékolja a direkt lézerfényt. A fény a hullámhosszhoz hasonló méretű struktúrákon minden irányba szóródik, a nagyobbakról inkább az eredeti irányának megfelelően halad tovább. Ezért kék az ég, és piros a nyugvó nap (apró páracseppek szétszórják a kék fényt), és az oldalszórás ezért jellemzőbb az apró granulumokkal teli sejtekre. bármely részecskéről (”sejtméret”) FALS Sensor FSC (forward angle light scatter, forward scatter) 90-os (oldal) fényszórás kisebb struktúrákról (organellumok, sejtfelszín) 90LS Sensor SSC (side scatter) 16

nagy érzékenységű fotodetektorok (fotoelektron sokszorozók – PMT A mért paraméterek: Fluoreszcencia Lézer FALS Sensor FSC nagy érzékenységű fotodetektorok (fotoelektron sokszorozók – PMT photon multiplayer tubes) fluoreszcens festékek vagy autofluoreszcencia (piridinek és flavinok jelenléte miatt) 17

Az áramlási és az optikai rendszer elvi felépítése fényérzékelők spec. tükrök és fényszűrők PMT 4 vizsgálandó sejtek Dikroikus tükrök: csak egy adott hullámhosszóság alatti vagy feletti fényt áteresztő a többit tükröző tükör. Ferdén elhelyezve a megfelelő színű fény leválasztható a többiről. Sávszűrők: adott hullámhossz tarrományú fényt áteresztő, a többit elnyelő „klasszikus” fényszűrők. PMT – fotoelektron sokszorozó (photomultiplayer tube) PMT 3 áramlási cella PMT 2 FSC érzékelő PMT 1 Lézer(ek) 18

A perifériás vérben jelenlévő fő limfocita populációk A mérés elve egy példán keresztül: A CD4+ (helper) és a CD8+ (citotoxikus) T sejtek arányának Meghatározása perifériás vérben (pl. AIDS progresszió nyomon követése) Jelölő anyagok: FITC jelzéssel ellátott anti-CD4 ellenanyag (α-CD4-FITC) PE jelzéssel ellátott anti-CD8 ellenanyag (α-CD8-PE) Azért az NK sejteken is lehet (valamennyi) CD8 Th NK Tc B A perifériás vérben jelenlévő fő limfocita populációk Fluoreszcens mikroszkóppal valami ilyesmit látnánk

nagy sebességű folyadékáram A CD4-FITC jelölt (TH) sejt (küvettában, vagy szabadon) A CD4-FITC jelölt (TH) sejt detektálása jelfeldolgozó egység Képernyő detektor CD8 PE növekvő fényintenzitás Fókuszált lézernyaláb A CD4+ CD8- sejtet szimbolizáló pont mikroszkóppal: CD4 FITC

A CD8-PE jelölt (Tc) sejt detektálása jelfeldolgozó egység detektor CD8 PE növekvő fényintenzitás CD4 FITC

A jelöletlenül maradt sejtek detektálása (pl.B sejtek) jelfeldolgozó egység detektor CD8 PE növekvő fényintenzitás mikroszkóppal halványnak látszó (autofluoreszcens) sejt CD4 FITC

kvadráns statisztika 18% 0% CD8 PE 44% CD4 FITC 38% A statisztikai adatok mérés közben is megtekinhetők CD8 PE kvadráns statisztika 44% CD4 FITC 38%

Ábrázolásmódok 1. dot-plot contour- plot density- plot A „plot”-ok a különféle sejtek százalékos megoszlása bemutatásának eszközei. A klasszikus dot-plotban egy-egy pont egy-egy sejtet reprezentál. Normál vérben is előfordulnak kis mennyiségben CD4+/CD8+ duplapozitív sejtek! Az enyhén CD8+ sejtek valószínűleg NK sejtek.

Ábrázolásmódok 2. Hisztogramm A hisztogramm felfogható egy oldalról megtekintett kontúrplotként is. Ugyan sok esetben a hisztogrammokkal is lehet százalékos megoszlást bemutatni, de inkább a „festődés” mértékének (a kimutatandó sejtfelszíni molekulák mennyiségének) összehasonlítására való egyes minták közt. (Homogén sejtpopuláció hisztogrammja a normál eloszlásnak megfelelő) Az intenzitás értékek számszerűsíthetőek: ~ 7 ~ 1300

A különböző sejttípusoknak jellegzetes fényszórásuk van granulociták oldal irányú fényszórás - SSC (granuláltság, a sejtek komplexitása) Perifériás vér mononukleáris sejtjeinek fényszórása (a vizsgálatot zavaró eritrociták elötte lizálva lettek) Látható, hogy a granulált sejteknek milyen nagy az oldalszórásuk (SSC). A granulált sejtek előre irányuló szórása(FSC) is nagyobb a granulálatlanoknál, de kevésbbé nyilvánul meg az oldalszóráshoz képest. Az FSC nagysága ezért csak hasonló granuláltságú sejteknél jellemző a méretre. monociták limfociták előre irányuló fényszórás - FSC („méret”) 26

Perifériás vér vizsgálata hematológiai automatával Mért paraméterek: peroxidáz festés (mieloperoxidáz jelenléte, x – tengelyen) fényszórás (nagy granulált sejteknél magas, y –tengelyen) 1 Zaj 2 Magvas vörösvérsejt 3 Összetapadt thrombociták 4 Limfociták és bazofilek 5 Nagy nemfestődő sejtek (LUC) 6 Monociták 7 Neutrofilek 8 Eozinofilek Vérkép kérésekor kb, ezeknek megfelelő százalékos adatokat küldi vissza a labor mieloperoxidáz van az eozinofil, neutrofil granulocitákban és a monocitákban – megfelelő szubsztráttal festődnek a sejtek, ezt érzékeli a hematológiai automata. (de ez nem immunhisztokiémia, hanem inkább hagyományos hisztokémiai festés –jobb helye lenne ennek az ábrának az immunrendszer sejtjei/molekulái szemináriumon!!!) Nagy nem festődő sejtek (LUC): • Aktivált lymphocyták • Plazmasejtek • Hajas sejtek • Gyermekkori nagy lymphocytak • Myeloperoxidáz negatív blasztok • Myeloperoxidaz negativ neutrophil granulocyta Csak a főbb sejtípusokat lehet meghatározni vele

A vérminta vörösvérsejt mentesítéséhez használt módszer befolyásolja a megmaradó sejtek százalékos összetételét az eritrociták lizálásával kapott eredmény sűrűség alapú elválasztással kapott eredmény (Ficoll) hiányzó granulociták

A ”kapuzás” segítségével az egyes populációk külön-külön jellemezhetők (gating) limfociták granulociták összes sejt monociták granulocita „kapu” A granulociták CD4 „expressziója” autofluoreszcencia vagy az FcR-ok általi aspecifikus kötődés következménye – csak kontroll ellenanyaggal összehasonlítva szabad kimondani valamiről, hogy pozitív monocita „kapu” limfocita „kapu” 29

De vannak problémás esetek is! Az előző ábrával kapcsolatban felmerülhet, hogy honnan lehet megállapítani, hogy egy adott sejt valóban specifikusan jelölődött-e vagy az autofluoreszcencia miatt látszik jelöltnek? A CD4 jelölés a limfociták esetében egyértelmű volt a helyzet, mert a + és – populáció egyszerre volt jelen, és a CD4+ limfociták könnyen elkülöníthetőek a CD4- limfocitáktól. De vannak problémás esetek is! Pl. CD1a, MHC szerű molekulát expresszáló dendritikus sejtek arányának meghatározása Honnan számítanak a sejtek pozitívnak?

? Összehasonlítás egy festetlen kontrol mintával (vagy izotípus kontrol ellenanyaggal „jelölt”) humán CD1a specifikus, egér IgG1 „kontrol” egér IgG1 ellenanyag (pl. DNP specifikus) DNP = dinitrofenil (haptén). Az ellene termeltetett ellenanyagok nem valószínű, hogy az emberi sejteken bármit is felismernének. Hol húzzuk meg a határt? 31

A hisztogrammos ábrázolásmód sok esetben megtévesztő lehet Együtt ábrázolva a specifikus festődést egy más hullámhosszon mért autofluoreszcenciával: autofloureszcencia IgG1 izotípus kontroll ellenagyag CD1a autofluoreszcencia Az izotípus kontroll ellenanyaggal „jelölt” minta segítségével kijelölhető a várt CD1a+ sejtek helye A hisztogramm elfedi ezeket a sejteket DNP = dinitrofenil (haptén). Az ellene termeltetett ellenanyagok nem valószínű, hogy az emberi sejteken bármit is felismernének. A hisztogrammos ábrázolásmód sok esetben megtévesztő lehet 32

Sejtek fenotípusa mellett a sejtek állapota/funkciója is vizsgálható (Nem immunológiai módszerek!) Sejtek fenotípusa mellett a sejtek állapota/funkciója is vizsgálható A sejt anyagcseréjének intenzitását jelezheti a benne levő mitokondriumok száma - ez a mitokondriumokat specifikusan festő anyagokkal (Mitotracker festékek) kimutatható – élő/halott sejtek is elkülöníthetők vele MitoTracker Red A sejtek nukleinsav mennyisége kimutatható a nukleinsavakhoz sztöhio-metrikus mennyiségben kötődő festékekkel. Ilyen, a duplaszálú nuklein-savakba (DNS v. RNS) interkalálódó festék: propidium jodid ethidium bromid N+ C2H2)3 NH2 C2H5 CH3 Propidium Ethidium

blasztos transzformáció Sejtciklus analízis a sejtciklusba lépő sejtek mérete megnövekszik = blasztos transzformáció transzkripció kimutatása (RT-PCR) fehérjék kimutatása (Immunoassay) sejtszám változás meghatározása (CFSE) DNS mennyiség meghatározása (fluoreszcens DNS interkalátorok, 3H-timidin)

A sejtciklus vizsgálható a DNS mennyiség alapján, pl. a DNS-be sztöhiometrikus módon interkalálódó fluoreszcens festékekkel (propidium jodid, PI) G0 M G2 DNS analízis (pl.aneuploidia diagnosztikájához) G1 G0 G1 s sejtszám Ha egymáshoz tapad 2db G0/G1 sejt (pl. Az osztódás után, vagy a SLAM miatt  ), akkor a méréskor úgy látszanak mintha G2 –ben lenne egy sejt. Ez az artefaktum az ún. doublet-discrimination módszerrel kizárható. A sejt áthaladási idejét méri a lézeren: a dupla sejtnek kétszer annyi idő kell. Ez alapján kikapuzható. s G2 M 2N 4N 200 400 600 800 1000 DNS mennyiség Egy sejtpopuláció sejtjeinek eloszlása DNS mennyiség alapján (áramlási citometriás ábra) 35

A typical DNA Histogram DNA Analysis A typical DNA Histogram PI – propidium jodid; szub G0/G1 sejtek – fragmentálódott DNS-ű apoptotikus sejtek (lásd később) szub G0/G1 sejtek 200 400 600 800 1000 2N 4N PI Fluorescence 36

normál sejtciklusú sejtek A sejtciklusra jellemző (intracelluláris) fehérjék megjelenésének a kimutatásával (ellenanyagokkal) további lehetőségek nyílnak a sejtciklus, és az osztódó sejtek kimutatására: Ciklinek, Ki-67, PCNA Apoptózis kimutatása: DNS mennyiség csökkenése alapján Nukleoszómák közötti DNS hasítás során keletkező DNS végek jelölése: BrDU avagy dUTP és Tdt (terminális deoxinukleotidil transzferáz) A sejtmembrán normális esetben intracelluláris oldalán levő foszfatidil szerin molekulái megjelennek az extracelluláris oldalon. Fluoreszceinnel konjugált Annexin V jelölés szub G0/G1 sejtek Ki-67 – osztódó sejtekben expresszálódik, nem tudom tudni-e a funkcióját PCNA – Proliferating Cell Nuclear Antigen (nem szigorúan sejtosztódás specifikus, mert a DNS sérüléskor/hibajavításnál is expresszálódhat) dUTP (BrDU – bromo deoxi uridin) –t a fragmentált DNS szabad végeihez(3’ vagy 5’?) a Tdt kapcsolja hozzá. Lehet közvetlenül jelölt (pl. biotinnal), vagy lehet használni specifikus ellenanyagot a kimutatására. Annexinek – Ca2+ dependens foszfolipid kötő molekulacsalád. Fluoreszcens festékkel jelölhető. normál sejtciklusú sejtek 37

Kromoszóma Analízis és szeparálás Kromoszómák is analizálhatóak és izolálhatóak áramlási citométerrel megfelelő kezelés után. Elterjedt módszer két különböző DNS festék használata: a Hoechst 33258, amely AT-gazdag régiókhoz, és a chromomycin A3, amely GC-gazdag régiókhoz kötve a kromoszómák jellegzetes festődését okozza. Alapja: a kromoszómák eltérő AT/GC aránya Kromoszóma szeparálás pl. genomikai vizsgálatokhoz lehet hasznos (kromoszóma specifikus pool-ok létrehozása genom projecthez) 38

Normal human Normal hamster Human X hamster Normal mouse Hoechst 33258 Chromomycin A3 39 J.W. Gray & L.S. Cram

homogén populációban sejtenként mérve Kinetikai mérések citométerrel Homogén sejtpopulációban egy-egy sejtek valamely tulajdonságának egymás utáni megmérése, annak időbeli változására enged következtetni homogén populációban sejtenként mérve 1 sejtben mérve Megfelelő indikátor használatával lehetséges az intracelluláris Ca2+ szignál mérése Ilyen a sejtbe „tölthető” fluoreszcens Ca2+ indikátor festék a Fluo-3 vagy az Indo-1

Jelátvitelhez kapcsolódó kinetikai mérések Fluo-3 AM – kékfénnyel gerjeszthető Indo-1 AM – UV fénnyel gerjeszthető Ezek az indikátor festékek apoláros csoporthoz kapcsoltak (pl. acetoxi-metilészter = AM), ezért képesek átjutni a sejtmembránon. A sejtben észterázok lehasítják ezeket a csoportokat, így a polárossá vált fluorokróm csapdába esik a sejtben. példa – intracelluláris Ca2+ jel egy sejtben kimutatva: antigén prezentáló B sejt T sejtet aktivál (klikk a képre) B sejt T sejt

Az intracelluláris Ca2+ szinttel arányos fluoreszcencia Ca2+ szignál mérése áramlási citométerrel Az intracelluláris Ca2+ szinttel arányos fluoreszcencia idő pl. Fluo-3 vagy Indo-1 Magyarázat a következő ábrán a sejtek aktiválása alapjel 42

Ca2+ szignál mérése áramlási citométerrel Influenza vírus hemagglutinin fehérje eredetű peptidre specifikus T sejt hibridóma Ca2+ szignálja a peptidet bemutató antigén prezentáló sejt hatására. Aktiválódott T sejtek A sejtek aktiválásával eltelő idő (az APC és T sejt összecentrifugálása) 1. Alapjel: aktiválatlan sejtek normál Ca2+ szintjének megfelelö fluoreszcencia (Legalul a ”tengelyen” fekete sávként látszik a festetlen APC-k autofluoreszcens sávja is.) 2. Aktiválás: a sejteket tartalmazó csövet kivesszük a citométerböl, majd gyorsan lecentrifugáljuk. Az egymásra centrifugált sejtek képesek receptor-receptor (MHC-TCR) kapcsolatot kialakítani egymással. Ez alatt az idö alatt a citométer nem mér eseményeket. Ez az üres sáv oka. (Látni néhány a készülékben ragadt ”szennyezö” sejtet is közben.) 3. A sejteket gyorsan felszuszpendáljuk, és visszahelyezzük a citométerbe. Az aktiválódott T sejtek magasabb fluoreszcenciát mutatnak. A hirtelen nyomásváltozástól az áramlás legelején a sejtek még turbulensen áramlanak, ezért az a rövid függöleges fekete sáv. Az APC-k sávja alul itt is látható. B sejtek esetén az aktiválás pl. a sejtekhez adott BCR elleni ellenanyaggal történhet, és sokkal rövidebb idöt igényel, ezért esetleg látható lenne a Ca2+ szignál felfutása is. Aktiválatlan T sejtek 43

Imaging cytometry CIRKULARITÁS tükrözheti: sejtek differenciáltsága (Részletesebb morfológiai információk – komoly képanalízis szoftver dolgozik a háttérben) CIRKULARITÁS tükrözheti: sejtek differenciáltsága sejtosztódás vándorló sejtek forrás: www.amnis.com brosúra

Fagocitózis vizsgálata fagocita sejtek egyszerű áramlási citometriás hisztogrammja fluoreszcens latexgyöngyök fagocitózisa után Fagocitózis vizsgálata

Az immunrendszer sejtjeinek és a vér alkotóinak szeparálása A számunkra érdekes sejtek fizikai elválasztása a heterogén populációból A különböző sejtek eltérő tulajdonságai alapján történik a szétválasztás (jó esetben ez a tulajdonság élő sejteken is megragadható – az élő sejtekkel további vizsgálatok végezhetők) fizikai – sűrűség, méret sejtbiológiai – adherencia, fagocitózis, érzékenység a közegre immunológiai – eltérő (sejtfelszíni) antigének Angolban két szó is van visszanyerésre (theoretical)yield – elméleti érték – a maximálisan kinyerhető sejtek mennyisége/százaléka recovery - téynlegesen kinyert sejtek mennyisége/százaléka Pl. egy mintában100 sejt van, és ezek 60% CD4+ . A szerparálással 60 db sejtet kaphatunk mint yield (elvileg), de csak 50-et (50%) kapunk a folyamat végén (recovery) A percentage yield a kettő aránya ( x 100) Szeparálás eredményességét jelezi: tisztaság kinyerés avagy visszanyerés hatékonysága (veszteség) sejtek életképessége 47

Szeparáció Kétféle alap hozzáállás: pozitív szeparáció – a kívánt sejtek megjelölése és elkülönítése a többitől Pl. a sejtek valamelyik felszíni molekuláját (receptorát!) fluoreszcens ellenanyaggal jelöljük. A sejteket a szeparálási procedúra körülményei mellett a receptorához között ellenanyag direkt módon befolyásolhatja! A pozitív szeparáció viszont gyakran nagyobb tisztaságot eredményez. negatív szeparáció – a nemkívánatos sejtek megjelölése, és megszabadulás tőlük (depléció) A szeparálandó sejtet csak a procedúra egyéb körülményei befolyásolják. Funkcionális vizsgálatok esetében inkább ezt használják.

Ember esetében a vér viszonylag egyszerűen hozzáférhető „alapanyag” az immunrendszer egyes sejttípusainak izolálásához Sejtes elemek egyszerű elválasztása a vérplazmától: Szeparáció szűréssel (egyszerű membrán v. holofiber „membrán”) Pore diameter for plasma separation: 0.2 to 0.6μm Plazma szeparálásához használják 49

A folyamat centrifugálással gyorsítható A sűrűségkülönbség miatt az alvadás gátolt vér idővel magától is három részre szeparálódik: alul: leülepedett vörösvérsejtek felül: sejtmentes vérplazma a kettő között a vörösvérsejtekre rétegződő buffy coat  fehérvérsejtek és vérlemezkék rétege buffy – buff: The color of buff; a light yellow, shading toward pink, gray, or brown. We spin a tube of anticoagulated blood. The RBCs settle first, they're the densest. The WBCs make a layer or "Coat" on top of the RBCs. The more WBCs, the greater the thickness of the Buffy layer. Note in the case of the leukemia in this picture, there is not only a thickened buffy layer, but the there are fewer RBCs, owing to the anemia associated with the leukemic process. A folyamat centrifugálással gyorsítható 50

Ha valamelyik alkotót valamilyen célból eltávolítják  Aferezis Aferezis (ógörög, ἀφαίρεσις) -“elvétel” A szeparált komponensen kezelés végezhető és a többi komponenssel együtt visszaadható. Donációs célú aferezis Terápiás aferezis Donor aferezis: Plazmaferezis – feldolgozva (pl.IVIG) vagy friss fagyasztott plazmaként immundefficiens személyeknek vagy akut fertőzésekkor passzív immunizáláshoz Vérlemezkék (trombocitaferezis) – koncentrált formában örökletes vagy indukált trombocitopénia (fertőzések, kemoterápia, besugárzás) vagy trombocita diszfunkció esetén Vörösvérsejtek (eritrocitaferezis) - különféle anémiás betegek számára (örökletes vagy műtéti, baleseti, belső és külső vérzések esetében, sarlósejtes anémia) Leukociták (leukaferezis) – buffy-coat, főként autotranszplantációhoz pl. kemoterápiás kezelést megelőzően a leukociták védelme miatt monociták szeparálásához dendritikus sejt terápia céljára őssejt terápiás célra a csontvelői őssejtek mobilizációja után végzett leukaferezis (ugyanez az autológ és allogén csontvelő átültetés egyik lehetőségeként is szóbajöhet) : Plasmapheresis - blood plasma. Plasmapheresis is useful in collecting FFP (fresh frozen plasma) of a particular ABO group. Commercial uses aside from FFP for this procedure include immune globulin products, plasma derivatives, and collection of rare WBC and RBC antibodies. Erythrocytapheresis- red blood cells. Erythrocytapheresis is the separation of erythrocytes from whole blood. It is most commonly accomplished using the method of centrifugal sedimentation. This process is used for red blood cell diseases such as sickle cell crises or severe malaria. The automated red blood cell collection procedure for donating erythrocytes is referred to as 'Double Reds' or 'Double Red Cell Apheresis.'[1] Plateletpheresis (thrombapheresis, thrombocytapheresis) - blood platelets. Plateletpheresis, like it sounds, is the collection of platelets by apheresis; while returning the RBC's, WBC's, and component plasma. The yield is normally the equivalent of between six and ten random platelet concentrates. Quality control demands the platelets from apheresis be equal to or greater than 3.0 × 1011 in number and have a pH of equal to or greater than 6.2 in 90% of the products tested and must be used within five days. Leukapheresis - leukocytes (white blood cells). Leukopheresis is the removal of PMN's, basophils, eosinophils for transfusion into patients whose PMN's are ineffective or traditional therapy has failed. There is limited data to suggest the benefit of granulocyte infusion. The complications of this procedure are the difficulty in collection and short shelf life (24 hours at 20 to 24°C). Since the "buffy coat" layer sits directly atop the RBC layer, HES (Hydroxyethyl starch?), a sedimenting agent, is employed to improve yield while minimizing RBC collection. Quality control demands the resultant concentrate be 1.0 × 1010 granulocytes in 75% of the units tested and that the product be irradiated to avoid graft-versus-host disease (inactivate lymphocytes). Irradiation does not affect PMN function. Since there is usually a small amount of RBC's collected, ABO compatibility should be employed when feasible. Stem cell harvesting - circulating bone marrow cells are harvested to use in bone marrow transplantation. Plasma exchange - removal of the liquid portion of blood to remove harmful substances. The plasma is replaced with a replacement solution. LDL apheresis - removal of low density lipoprotein in patients with familial hypercholesterolemia. Photopheresis - used to treat graft-versus-host disease, cutaneous T-cell lymphoma, and rejection in heart transplantation. Immunoadsorbtion with Staphylococcal protein A or G -agarose column - removal of allo- and autoantibodies (in autoimmune diseases, transplant rejection, hemophilia) by directing plasma through protein A-agarose columns. Protein A is a cell wall component produced by several strains of Staphylococcus aureus which binds to the Fc region of IgG. Leukocytapheresis - removal of malignant white blood cells in people with leukemia and very high white blood cell counts causing symptoms. Thrombocytapheresis - removal of platelets in people with symptoms from extreme elevations in platelet count such as those with Essential Thrombasthenia or Polycythemia vera 51

Terápiás aferezis: Vér abnormális oldott vagy sejtes komponensének eltávolítása Diszfunkcionális komponens eltávolítása és helyettesítése az egészséges donor aferezis termékeivel Vér komponensének megváltoztatása (ex vivo terápia) Leukaferezis – leukémiák esetében az extrém magas fehérvérsejtszám hemosztázis problémákhoz vezethet (nehéz légzés, látás zavarok), krónikus gyulladásos megbetegedéseknél csökkenthető vele a gyulladásos sejtek száma (ulceratív colitis, rheumatoid arthritis) LDL aferezis – pl. familiáris hiperkoleszterinémia esetében (ApoB affinitás oszloppal, vagy acetátos kémiai precipitációval) Trombocitaferezis – esszenciális trombocitémia/trombocitózis esetén (trombózisok és vérzések) a diszfunkcionális magas trombocitaszám gyors csökkentése az életveszély elkerülésére Eritrocitaferezis - pl. sarlósejtes anémiában sarlósejtes krízis felléptekor a rendellenes vvs-ek eltávolítása/cseréje Plazmacsere – autoimun betegségekben, az autoellenanyagokat tartalmazó plazma eltávolítása, és helyettesítése (immunszuppresszióval kombinálva) (pl. Myasthenia gravis, Guillain-Barré szindróma, lupus, Goodpasture szindróma, Antifoszfolipid antitest szindróma, Behcet szindróma, stb….) Immunadszorpció protein A v. G oszloppal – auto- vagy allo-ellenanyagok eltávolítása a plazmából autoimmun-, transzplantációs kilökődési- esetleg hemofíliás zavarokban protein A v. protein G oszlopon keresztül vezetéssel Essential thrombocytosis - The major symptoms are bleeding and thrombosis. Platelets derived from the abnormal megakaryocytes do not function properly, which contributes to the clinical features of bleeding and thrombosis. ApoB – apolipoprotein B az LDL-re jellemző fehérje

Folyamatos áramú aferezis rendszerek Continuous Flow Centrifugation (CFC) Folyamatos áramú centrifugálás aferezis és változatai: http://en.wikipedia.org/wiki/Apheresis http://www.transfusionmedicine.ca/articles/buffy-coat-component-production-method Régi típusú mosható/újra felhasználható aferezis centrifuga betét keresztmetszeti képe Megfelelő centrifugálási módszerrel trombociták és trombocita mentes plazma is kinyerhető 53

A vérből ilyen módon szeparált fehérvérsejtek még túl „szennyezettek” vörösvérsejtekkel további vizsgálatok számára Ficoll is a neutral, highly branched, high-mass, hydrophilic polysaccharide which dissolves readily in aqueous solutions . Ficoll-Paque (1.077g/ml) 54

(from Google pictures) (Nature Protocols http://www.nature.com/nprot/journal/v3/n6/images/nprot.2008.69-F1.jpg)

Ficoll-Paque sűrűség alapú sejtszeparáció perifériás vér vékony pipettával a sejtek alá töltött Ficoll mononukleáris sejteket tartalmazó „gyűrű” átpipettázása centrifugálás szeparált, tisztított sejtek Ez a differential centrifugation plazma ficoll vvt-k mononukleáris sejtek (MNS, PBMC) neutrofil granulociták 56

Percoll – neutrofil granulociták szeparálásához Physical chemical characterization of Percoll. I-III. Laurent, T.C. et al. Colloid Interface Sci. 76, 124–145 (1980). Percoll: The silica in Percoll is a sodium-stabilized colloid, which is polydisperse with particle diameters between 10 nm and 30 nm [7]. Pure silica is toxic to cells and causes hemolysis of red blood cells [11]. The particles are coated with polyvinylpyrrolidone (PVP) to avoid the toxic effect. The density gradient method of separation has advantages over the normal differential centrifugation; there is no mixture of materials beneath the sample zone, cells and particles of the same size, shape and density sediment as separate zones without convection. Selfgenerating gradient technique – continous gradient lépcsős vagy folyamatos pecoll gradiensen a neutrofil granulociták is elkülöníthetőek 57 Romanian J. Biophys., Vol. 14, Nos. 1–4, P. 53–58, Bucharest, 2004

Rozetta képzést felhasználva a Ficoll szeparáció felhasználható a nemkívánatos sejtek eltávolításához is A az eltávolítandó sejtre, és a vvt specifikus ellenanyag azonos típusú. A sejtekből és ezekből, erre az ellenanyagra specifikus második ellenanyag nagy komplexeket hozhat létre (rozetta). A vvt-k így magukkal viszik ezeket a sejteket is. Lehet ilyen negatív szeparációs kiteket kapni! Negatív szeparáció 58

Az adherens sejtek kinyerése vagy eltávolítása (negatív és pozitív szeparáció) Olcsó, egyszerű, de csak az adherens sejtek elválasztására alkalmas, és alacsony tisztaságú 59

kitapasztott ellenanyagok Ellenanyag ”panning” (negatív és pozitív szeparáció) kitapasztott ellenanyagok 60

Komplement mediált lízis ellenanyagok komplement LÍZIS (negatív szeparáció) (A vörösvérsejtek enyhén hipotóniás ammónium-klorid pufferben lizálhatóak) 61

Egyszerű mágneses sejtszeparálás Fagocita sejtek apró vasszemcséket képesek fagocitálni, ezután egy erős mágnessel elválaszthatóak más sejtektől Mágneses sejtszeparálás - MACS (1.) specifikus ellenanyag paramágnesesség – nem mágneses anyag, ami mágneses térben maga is mágnesessé válik (pl. vas) paramágneses gyöngy („bead”)

MACS (2.)

Mágneses sejtszeparálás - MACS (3.) oszlop AZ ELVE KICSIT HASONLÓ AZ IMMUNSZORBENS TECHNIKÁHOZ Nem jelölt sejtek kinyerése (negatív szeparáció), vagy eltávolítása (depléció) jelölt sejtek kinyerése (pozitív szeparáció)

Mágneses oszlop Mágneses oszlop

CliniMACS – zárt rendszerű mágneses sejt szeparátor CliniMACS Plus CliniMACS® Prodigy „coming soon”

A sejteket jelölő mágneses részecskék nagyon kicsik, a sejtfunkciókat általában nem befolyásolják                                                                           CD8+ T cells „DETACHaBEAD” DETACHaBEAD is a polyclonal antibody specifically made according to a patent applied invention. The antibody is produced by immunising sheep with Fab fragments made from purified papain digests of mouse immunoglobulin. DETACHaBEAD is the globulin fraction of serum as obtained with 50% ammonium sulphate precipitation. It is supplied in 0.15M phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4, without any preservatives added. No cross reaction with human IgG, IgM or IgA has been detected in quantitative ELISA tests. Valószínűleg anti idiotipus antitestek is vannak benne, ezek kompetitálhatnak az antigénnel „DETACHaBEAD” Az mágneses részecskékkel konjugált ellenanyagok Fab része ellen termeltetett poliklonális ellenanyagokkal (amelyek valószínűleg anti-idiotipus antitesteket is tartalmaznak) elérhető, hogy leváljanak a sejtekről. (kompetíció a sejtfelszíni antigén és az anti-idiotípus ellenanyag között)

elvileg bármely detektálható populáció kiválasztható, és elkülöníthető FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting) elvileg bármely detektálható populáció kiválasztható, és elkülöníthető fényszórás alapján specifikus fluoreszcencia alapján PMT 4 Minta PMT 3 Áramlási cella PMT 2 PMT 1 Laser

CD antigén sejttípus funkció ligand T sejtek T sejt antigén receptor jelátvivő része (Intracelluláris kináz, foszfatáz) CD4 helper T sejtek, (monociták, pDC) T sejt antigénreceptor koreceptora, (HIV receptor) MHC- II, HIV CD5 T sejtek, (B sejt alpopuláció: B1) sejt adhézió, jelátvitel (kostimuláció) CD72 CD8 citotoxikus T sejtek, (NK,  T sejt alpopuláció) T sejt antigénreceptor koreceptora MHC I CD14 Monociták, makrofágok, granulociták egy része LPS receptor része LPS, LBP CD19 B sejtek CR2 része, B sejt antigénreceptor koreceptora C3d, C3b CD28 kostimuláció (B7-1, B7-2) CD80, CD86 CD34 hematopoietikus progenitor sejt (endotheliális sejtek) sejt adhézió CD62L (L-szelektin) CD56 NK sejtek, (T és B sejt alpopuláció) homoadhézió (N-CAM izoform) CD80, CD86 (B7-1, -2) professzionális APC: DC, B, monocita, makrofág kostimuláció, sejt adhézió CD28, CD152 Ezek jó része elhangzott/elhangzik az előadások és szemináriumok során. LPS – lipopoliszaharid LBP – lipopoliszacharid kötő fehérje CR2 – komplement receptor 2 (liganduma: C3d és C3b) (A C3d a C3b-ből keletkező fragment. Nem enzimaktív, de nagyon hatékony opszonin)

B1 sejtek elválasztása (CD19/CD5) NKT sejtek elválasztása (CD3/CD56) Például: B1 sejtek elválasztása (CD19/CD5) NKT sejtek elválasztása (CD3/CD56) NK sejtek NKT sejtek válasz a kérdésre: először negatív aztán pozitív szelekcióval limfociták Mágneses szeparálással hogyan lehetne ezt megcsinálni? 70

Az áramlási cella vibrációjának hatására folyadéksugár a frekvenciától függően, adott stabil helyen cseppekre bomlik A rezgés piezoelektromosságon alapul. Ultrahang frekvenciájú (15-100 kHz). Azonos frekvenciával megvilágítva (stroboszkóp) a rezgésenként képződő cseppek állni látszanak. A cseppképződési pontot befolyásolja a rezgés frekvenciája, amplitúdója, a folyadékáram sebessége, stb. breakoff point 71

- - - - - - - - - + + + + Lézer vibráció + Ha a szeparálandó sejt eléri a csepp-képződési pontot, a folyadéksugárra arra az időre elektromos töltés kapcsolódik, így a leváló csepp töltötté válik. - + - A lézeres detektáláshoz képest a töltés bekapcsolását ennek megfelelően időben annyival később végzi a berendezés, amennyivel később a folyadékáramban levő sejt eléri a csepp-képződés helyét (”drop-delay”). Ez a késleltetési idő, ismerve frekvenciát, a megvilágítás és a csepp-képződési pont közötti távolságot, és a cseppek távolságát (azaz a ”cseppképződés hullámhosszt”) kiszámolható, és a berendezésen beállítható. + Elektromosan töltött eltérítő lemezek + Elektromosan töltött eltérítő lemezek + + + - + + + - - - - - - Gyűjtőcső Gyűjtőcső 72

Szorter vezérlő szoftverének képe. Középtájon (bal képernyő jobb széle) látható a cseppképződés aktuális állapota (stroboszkóp miatt látszanak állni a cseppek) A jobb oldalt a sejtpopulációk és a bekarikázással (kapuzással) kijelölt szeparálandó sejtek (CD123+ PDC szerű sejtvonal szeparálása)

Az immunrendszer sejtjeinek funkcionális vizsgálata

Az immundeficienciák nagy része különböző funkcionális vizsgálatokkal mutathatók ki. A limfociták antigénnel való aktiválása technikailag nehezen lenne kivitelezhető, mert az antigén-specifikus T- és B-sejtek gyakorisága kicsi. Poliklonális T-/B-sejt aktivációt kiváltó anyagokkal, és módszerekkel végezhető el a sejtek funkcionális vizsgálata.

A limfociták poliklonális aktivációja LPS, lektinek, PMA/ionomicin jelenlétében B sejt T sejt T sejt LPS is a polyclonal B-cell activator in mice. LPS works via CD14 and TLR4 receptor. Az Ionomycin a külső Ca2+ ionok beengedésével aktiválja a sejteket, szinergizálva a protein kináz C-hez kötődő PMA-val A lektinek (pl. Con A, PHA) szénhidrát kötő fehérjék. A sejtfelszíni glikozilált receptorok keresztkötésével aktiválják a sejteket. LPS a CD14+TLR4 komplexen keresztül aktiválja a sejteket BCR vagy TCR-specifikus ellenanyagok is a megfelelő sejtek poliklonális aktivációját okozzák

Poliklonális T sejt aktivátorok Poliklonális B sejt aktivátorok hatásai Aktivátor T sejt függés Ig szekréció Humán B sejt PWM (pokeweed mitogen) nincs van SpA (szuperantigén, staphylococcus protein A) EBV (transzformáló hatású is) Anti-Ig citokinek jelenlétében Egér B sejt LPS PWM PPD (purified protein derivate, mikobakteriumból) pokeweed - Phytolacca americana (Álkörmös) Poliklonális T sejt aktivátorok Phytohaemagglutinin (PHA) lektin Canavalia ensiformis Concanavalin A (ConA) Phaseolus vulgaris anti-CD3 Monoklonális ellenanyag

Pokeweed (PWM) (Phytolacca americana) - Álkörmös Termését borszínezésre használták, aztán rájöttek, hogy mérgező (triterpénszaponin, és mitogén lektin) Mo.-n dísznövényként tartják Chenopodiales (libatopvirágúak) Phytolaccaceae (álkörmösfélék)

Phytohaemagglutinin (PHA)  Canavalia ensiformis – Jackbean, Sword bean - Kardbab

Concanavalin A (ConA)  Phaseolus vulgaris – (vetemény) bab