Az elsődleges antigén – ellenanyag kapcsolódáson alapuló preparatív és analitikai módszerek (1.) Immunoszorbens technikák ELISA

Az immunoesszék érzékenysége

Ellenanyag tisztítás antigén immunszorbensen oszlop polimer gyöngyök oszlop töltelék affinity purifed antibody : a katalógusokból rendelhető ellenanyagokat ezzel a módszerrel tisztítják. rákötött antigének

tisztítandó ellenanyagok hozzáadása poliklonális ellenanyag kötődés mosás elúció Antigén specifikus poliklonális ellenanyag

hozzákötött antigén specifikus ellenanyagok Fordítva is összeállítható a rendszer: Fehérje(antigén) tisztítás ellenanyag immunszorbensen oszlop polimer gyöngy Tisztítandó oldat felvitele oszlop töltelék Kötődés Mosás Elúció hozzákötött antigén specifikus ellenanyagok Tisztított antigén

Immunprecipitáció http://en.wikipedia.org/wiki/Immunoprecipitation

ELISA Enzyme Linked Immune Sorbent Assay ELISA plate (lemez) lyuk avagy kút Különböző lemezek – speciális felület kezelés ellenanyag, peptid kötésre

felülethez, vagy ellenanyagokhoz kötődő antigének/ellenanyagok enzyme linked immune sorbent enzim felülethez, vagy ellenanyagokhoz kötődő antigének/ellenanyagok ellenanyaghoz konjugált enzim

Az ELISA vizsgálatban az antigén mennyiségével arányos mértékű az enzimaktivitás Az enzimaktivitás mértékére a katalizált színreakció mértékéből következtethetünk Hasonló elméleti alapokon nyugszik az összes elsődleges antigén-ellenanyag kölcsönhatáson alapuló immunoassay

Szekunder ellenanyagok Az ELISA, immunhisztokémia, citometria során használt módszerek alaptípusai (hatékonyság, érzékenység, kényelem, megbízhatóság, ár) Direkt módszer Indirekt módszer Jelzés Szekunder ellenanyagok Jelzés Primer ellenanyag Antigén

Enzim-antienzim rendszer Az ELISA, immunhisztokémia, citometria során használt módszerek alaptípusai Enzim-antienzim rendszer PAP – peroxidáz / anti-peroxidáz APAAP – alkalikus foszfatáz / anti-alkalikus foszfatáz Enzimek A primer ellenanyaggal azonos (izo)típusú enzim-specifikus ellenanyag Szekunder ellenanyag (faj v. izotípus specifikus) Primer ellenanyag Antigén

Biotin-avidin rendszerrel kombinált indirekt módszerek Az ELISA, immunhisztokémia, citometria során használt módszerek alaptípusai Biotin-avidin rendszerrel kombinált indirekt módszerek Az avidin nagy affinitással képes a biotint kötni Egyszerű ABC Avidin Biotin enzimComplexek Jel felerősítése Avidin-enzim komplexek Biotin-enzim komplex Avidin Biotinált ellenanyag Antigén

kombinált „szendvics” ELISA Kis koncentrációjú antigének (pl. citokinek, hormonok) kimutatása szendvics technikával. Szérumok, nem tiszta oldatok vagy keverékek esetén is ez használható (pl. liquor). citokin specifikus ”capture” ellenanyagok kitapasztása felesleges konjugátum kimosása A nem kötődő anyagok kimosása felesleges fehérjék kimosása telítés: a szabad plasztikfelület beborítása aspecifikus fehérjével felesleges ellenanyagok kimosása citokintartalmú minta hozzáadása eltérő antigén determinánst felismerő biotinilált ellenanyagok hozzáadása avidinnel konjugált enzim hozzáadása színreakcióhoz szükséges anyagok hozzáadása

Bioaktív anyagok kimutatása hCG (human coriogonadotropin) – terhességi tesztek Tumor antigének kimutatása Citokinek, hormonok kimutatása doppingvizsgálatok: EPO (erithropoetin), szteroid származékok kimutatása szendvics technikával vagy kompetíciós tesztekkel

Tumordiagnosztika A tumor specifikus (TSA,TSTA) és tumor asszociált (TAA) antigéneket felismerő ellenanyagok felhasználhatóak a diagnosztikában Szendvics technikával ezek az antigének kimutathatóak Tumor Ag specifikus csapda ellenanyaggal fedett felület (a kit része) Tumor Ag specifikus detektor/reporter ellenanyag (a kit része) Tumor antigén (pl. a beteg szérumából) Prosztata daganatok prosztata-specifikus antigén (PSA): Szérum koncentrációja magas a prosztata rákos, benignus prosztata hiperpláziás és prosztatitiszes páciensekben. A PSA szérum szintje korrelál a prosztata daganat méretével és a klinikai állapotával. hasonlóan felhasználható a prosztataspecifikus savas foszfatáz (PAP) mennyiségi kimutatása a szérumból

Pajzsmirigy daganatok: Hólyagrák: Az epiteliális sejtek NMP22 nukleáris mátrix proteinje egészséges emberekben csak kis mennyiségben található meg a vizeletben → megemelkedése diagnosztikus marker Pajzsmirigy daganatok: A szérum tiroglobulin (hTG) megemelkedett szintje diagnosztikus marker Alpha Fötoprotein (AFP) : 68kD-os protein, amit az embrionális máj és szikzacskó termel. Megjelenhet az anya szérumában is (transzplacentális transzfer). Születés utáni egy év alatt alacsony szérumszintre csökken le (<9ng/ml). Magasabb koncentrációja hepatómával, ovariális-, tesztikuláris- és preszakrális teratokarcinómákkal, de egyéb daganatokkal is összefüggésben lehet. Carcinoembryonic Antigen (CEA) sejtadhézióban vesz részt. Normális esetben csak az embrionális fejlődés során van jelen. Colorectális és egyéb carcinomát hordozó egyénekben megemelkedik a szérumszintje. Változásának nyomon követésével következtetni lehet a terápia hatékonyságára. Her-2/neu protein: 185 kD-os transzmembrán glikoprotein, tirozin kináz receptor. Az emlődaganatok 20-30%-ban a tumorsejtek megemelkedett mértékben expresszálják. Immunterápia során a működése blokkolható specifikus ellenanyaggal (Herceptin), ezért jelenlétét immunhisztokémiával, vagy immunfluoreszcenciás eljárással mutatják ki biopsziás mintákban.

Her-2/neu receptor szerepe az emlőrákban és a monoklonális Herceptin terápia mechanizmusa

egyszerű indirekt ELISA lépései Antigén specifikus ellenanyag, vagy az antigén egyszerű kimutatásához Példa: HIV fertőzöttség diagnosztikája a páciensben megjelenő HIV specifikus ellenanyagok kimutatásával - rekombináns HIV fehérje, vagy annak megfelelő szintetikus peptid segítségével az antigén kitapasztása (coating avagy fedés) felesleges ellenanyagok kimosása telítés: a szabad plasztikfelület beborítása aspecifikus fehérjével felesleges fehérjék kimosása felesleges antigén kimosása specifikus ellenanyagok hozzáadása Enzimmel konjugált szekunder ellenanyagok hozzáadása színreakcióhoz szükséges anyagok hozzáadása HIV burokfehérje, vagy nagy méretű szintetikus peptid

Fertőzések diagnosztikája Mivel szabad vírus antigének és vírus részecskék nem minden esetben detektálhatóak kellő hatékonysággal (pl. látencia), ezért helyette inkább a szervezetben képződött vírus specifikus ellenanyagokat mutatják ki a fertőzés diagnosztizálásakor. emberi Ig specifikus jelölt ellenanyagok jelzik a specifikus ellenanyagok jelenlétét a fertőzött személy szérumában található vírus specifikus ellenanyagok hozzákötnek az antigénhez vírus antigénnel fedett ELISA lemezek készen kaphatóak ilyen elven működik: Epstein-Barr Virus (EBV) teszt kit → EBNA-1 (EBV nukleáris antigén) segítségével mutatják ki az ellene termelt IgG-t HIV diagnosztikai kitben → rekombináns HIV antigénnel anti-HIV antitestek kimutatása vérből, plazmából, szérumból vagy akár beszáradt vérfoltból Toxoplazmózis (Toxoplazma gondii – egysejtű parazita) → Toxoplazma elleni IgM kimutatás A toxoplazmózis terhesség során veszélyes akkor, ha az anya elsődleges fertőzésben szenved. Ekkor IgM típusú ellenanyagok termelődnek a fertőzés hatására, melyek transzplacentálisan nem szállítódnak és ezzel nem nyújtanak védelmet a magzat számára. látencia – sok vírus képes a szervezetben inaktív, az immunrendszer számára sem látható módon létezni az életciklusának bizonyos szakaszaiban toxoplazma fertőzöttség és megemelkedett fiú születésszám: Naturwissenschaften. 2007 Feb;94(2):122-7. Epub 2006 Sep 30. http://www.frozenevolution.com/effect-parasite-toxoplasma-gondii-sex-ratio-human-beings

Autoimmunitás A különféle autoimmun folyamatokban megjelenő autoantitesteket is hasonló módszerekkel detektálják Pl. SLE (szisztémás lupus erythematosus): Immunkomplex betegség, melyben számos autoantigén ellen kimutathatóak autoantitestek. A leggyakoribb anitest a kettős szálú DNS elleni antitest (az SLE-ben szenvedő betegek 60%-ában kimutatható). I típusú (autoimmun) diabetesz diagnosztikája a sziget sejt antigének elleni autoantitestek kimutatásával ELISA vizsgálat segítségével: glutaminsav dekarboxiláz (GAD65): a prediabetikus személyek 70-90% -ban és a diabetikus betegekben specifikus ellenanyagot találni ellene IA-2 (tirosine foszfatáz-szerű protein): az I típusú diabeteszes betegek 50-75% -ban és közvetlenül a betegség megjelenése előtti állapotban specifikus ellenanyagot találni. Ilyen ellenanyagok megtalálhatóak egyes GAD ellenanyag negatív személyekben is, ezért független diabetesz markernek tekinthető. inzulin: a legfőképp de nem kizárólagosan autoimmun diabeteszes fiatal gyermekekben (<5 éves) találni ellenanyagot, (megemlítendő, hogy ezek az ellenanyagok nem megkülönböztethetőek azoktól, melyek az inzulin terápia során a szervezetben termelődnek)

izotípus specifikus ellenanyag Szérum ellenanyag izotípusok meghatározása A szervezetben jelenlevő antigén specifikus ellenanyagok utalnak az antigén jelenlétére (lásd pl. vírusfertőzések diagnosztikájánál). Az így kimutatott ellenanyagok izotípusa utalhat arra, hogy friss, perzisztáló fetőzésről (IgM ellenanyag dominancia), vagy korábbi fertőzést követő memória válasz eredményéről van-e szó (IgG ellenanyag dominancia). Anti-izotípus specifikus ellenanyagokkal ez eldönthető. anti-IgM anti-IgG Memória válasz IgM IgG Antigén Megemelkedett szérum IgE szintet tapasztalni atópia esetén, bizonyos autoimmun betegségekben, és egyes parazita fertőzések esetében Egyes immundeficienciákban az ellenanyag alosztályok koncentrációja eltér a normálistól (hiper IgM szindróma) (lásd a korábbi mielóma multiplex esettanulmányt is) ellenanyag capture-ellenanyag a szérum ellenanyaga izotípus specifikus ellenanyag

kompetitív ELISA Érzékenysége miatt szolubilis fázisban levő kis mennyiségű antigén kimutatásához használják. A mintában jelenlevő ismeretlen mennyiségű oldott antigén hozzáköt az ellenanyagokhoz, és így gátolja azok hozzákötődését a rendelkezésre álló, korábban a szilárd fázishoz tapasztott tisztított antigénhez. - A tisztított antigén kitapasztása a szilárd fázishoz és blokkolás - Az ismeretlen mennyiségű, szolubilis antigént tartalmazó vagy nem tartalmazó minta hozzáadása Jelölt ellenanyag hozzáadása, kötődés - Mosás - Kromogén anyagok hozzáadása

ELISA hibák Aspecifikus kitapadásból eredő hiba - akár közvetlenül Az antigén mellett a plasztik felületre kitapadhatnak maguk az ellenanyagok is - akár közvetlenül - akár indirekten a színreakció ugyan az A fehérjék aspecifikus kitapadása csökkenthető: telítéssel/blokkolással detergens alkalmazásával

Elkészült ELISA lemezek

pl. Human Chorio-Gonadotropin kimutatása szérumból vagy vizeletből Mindenki látott már ehhez hasonló diagnosztikai eszközöket, vagy ha nem, találkozni fog velük későbbi pályafutása során pl. Human Chorio-Gonadotropin kimutatása szérumból vagy vizeletből (terhességi teszt) Ezek az eszközök is az ELISA esetében már megismert elsődleges antigén-ellenanyag specifikus kapcsolódását kihasználó technikán alapulnak!

hCG kimutatása immunkromatográfiás tesztcsíkkal elölnézet oldalnézet abszorbciós rész (cellulóz, papír) kontroll ellenanyag sáv nitrocellulóz membrán hCG csapda ellenanyag sáv jelölt ellenanyagokkal átitatott üvegfilter (A jelzés szabad szemmel is látható!) abszorbciós lap, mintafelviteli rész Az „ellenanyaggal átitatottság” valószínűleg liofilizátumot jelent vizeletminta

a jelölt ellenanyagra specifikus ellenanyagok kontroll sáv teszt sáv van hCG nincs hCG kontroll ellenanyag sáv hCG csapda ellenanyag sáv A tesztcsíkook egy adott antigén koncentráció tartományra vannak belőve!!! Ennél a formánál a nagyon magas hCG koncentráció fals negativitást mutatna! : (hook effect – a sok szabad hCG ráköt a csapda sávra és az ellenanyaggal jelölt hCG már nem tud kikötni rá) jelölt ellenanyagok Analóg a szendvics ELISÁval hCG

Ugyanez kompetitív rendszerben kontroll sáv teszt sáv van hCG nincs hCG kontroll ellenanyag sáv a jelölt ellenanyagra specifikus ellenanyagok hCG sáv ( kikötött hCG) Analóg a kompetitív ELISÁval

kolloidális arany („surface plasmon” rezonancia színek) Az ellenanyagon található jelzés szabad szemmel is megfigyelhető, így nincs szükség enzimes folyamatokra, és egyéb reagensekre: kolloidális arany („surface plasmon” rezonancia színek) festékkel töltött latex gyöngyök Az eljárás szemikvantitatívá tehető Immunkromatográfiás tesztcsík egyéb felhasználási lehetőségei: élelmiszervizsgálat során toxinok kimutatása kolloidális méretű nemesfém partiulumoknak speciális fényelnyelési, gerjesztési, fényszórási sajátságai lehetnek, aminek eredményeképp intenzív színjelenséget tapasztalni. (élénk színűnek látszanak) A jelenség a localized surface plasmon resonance (LSPR) –hoz tartozik. Aflatoxins are naturally occurring mycotoxins that are produced by many species of Aspergillus, a fungus, the most notable ones being Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus. Aflatoxins are toxic and among the most carcinogenic substances known.  After entering the body, aflatoxins may be metabolized by the liver to a reactive epoxide intermediate or hydroxylated to become the less harmful aflatoxin M1 „Fáraó átkának” egy racionálisabb magyarázata Pl.: kompetitív immunkromatográfiás tesztcsíkok aflatoxin detektálására

Gyakorlati rész:

A koncentráció meghatározása Valamilyen indikátor mennyiségi jellemzője utal a koncentrációra pl: szín (abszorbancia, optikai denzitás) fluoreszcencia sejtszám (pl. növekedési hormon koncentráció meghatározása) Számszerűsíthető értéket ismert koncentrációjú mintával való összehasonlítás segítségével kaphatunk (standard) A sztenderddel összehasonlítás alapja: Ha két minta abszorbanciája azonos  koncentrációjuk is azonos DE EZ CSAK RÉSZBEN IGAZ!!!!

Ez az a tartomány, ami a koncentrációt jellemző értékeket ad A standard hígítási sora OD Ismeretlen koncentrációjú minta Az összehasonlíthatósághoz az ismeretlen mintából is hígításokat kell csinálni! Ez az a tartomány, ami a koncentrációt jellemző értékeket ad Az optikai denzitás alpján bármelyik lehetne ? 500 250 125 62 31 16 7.8 3.9 1.9 1000 0.97 0.49 0.24 0.12 0.061 0.030 0.015 0.007 0.004 koncentráció Szerencsés esetben, a minta OD-je a lineáris szakaszra esik, és nem kell hígítani.

A két csőben azonos a koncentráció Becslés „vonalzóval” Tehát az (eredeti hígítatlan) ismeretlen minta koncentrációja: 1.9x128 = 243.2μg/ml OD A két csőben azonos a koncentráció Az a tartomány, ahol az abszorbancia arányos a koncentrációval azonos OD-hoz tartozó pontok Az 1.9μg/ml-re hígított standard megfelel a… Felső és alsó lag fázis Egyenes egyenletébe, vagy alsó lag fázist felhasználva egy hígított minta alapján felszorozva hülyeséget számolni. Azonos 1000 500 250 125 62 31 16 7.8 3.9 1.9 0.97 0.49 0.24 0.12 0.030 0.061 0.007 0.015 0.004 0.002 standard koncentráció (µg/ml) (felező hígítás (log)) … 128-szorosra hígított ismeretlen mintának 2X 4X 8X 16X 32X 64X 128X 256X Ismeretlen minta hígításai

standard koncentráció (µg/ml) Ha felírjuk az egyenes szakaszok egyenleteit, eltehetjük a vonalzót, és elővehetjük a számítógépet OD Yminta=mx+b ystd=mx+b Felső és alsó lag fázis Egyenes egyenletébe, vagy alsó lag fázist felhasználva egy hígított minta alapján felszorozva hülyeséget számolni. Azonos 1000 500 250 125 62 31 16 7.8 3.9 1.9 0.97 0.49 0.24 0.12 0.030 0.061 0.007 0.015 0.004 0.002 standard koncentráció (µg/ml) (felező hígítás (log)) 2X 4X 8X 16X 32X 64X 128X 256X Ismeretlen minta hígításai

Durva hibák Tudatában kell lenni, hogy milyen abszorbancia érték tartományban használhajuk fel az OD értéket, ha egy egyenletbe szeretnénk visszahelyettesíteni, és az alapján koncentrációt számolni! OD Illeszett egyenes, egyenlettel y=mx+b  OD=m(koncentráció)+b Hígítási görbe Hasonló mondható erről az értékről is A felhasználható OD értékek ebbe a tartományba esnek Bármely töménységű oldat kellően nagy hígításának OD-je erre a részre fog esni. Az egyenletbe ezt az OD értéket behelyettesítve, és ez alapján a hígítást is figyelembevéve (visszaszorozva), óriási – hamis! – koncentációt kapunk eredményül koncentráció

Bemutatás ELISA plate-ek IFNγ standard, és T sejt kultúrák felülúszójának hígítási soraival Melyik a töményebb minta? Próbáld meg kiszámolni a koncentrációt a kiosztott ELISA adatokból otthon! számolj a 3 párhuzamos adat átlagával használd a hígítás logaritmusát a hígítási görbe ábrázolásánál próbálj táblázatkezelő programot használni a feladat megoldásához (egy példa megoldását megtalálod az intézet honlapján a gyakorlatok között)