immunoblot (Western blot) immunhisztokémia áramlási citometria AZ ELSŐDLEGES ANTIGÉN – ELLENANYAG KAPCSOLÓDÁSON ALAPULÓ PREPARATÍV ÉS ANALITIKAI MÓDSZEREK (2.) immunoblot (Western blot) immunhisztokémia áramlási citometria

AZ IMMUNOESSZÉK ÉRZÉKENYSÉGE

WESTERN BLOT Lépések: minta előkészítés (szöveti vagy sejtes) gélelektroforézis blottolás jelölés előhívás Anode(+) Cathode(-) Nitrocellulóz vagy Polyvinylidén Fluorid (PVDF) membrán Felhasználás: fehérje keverékek egyes komponenseinek ellenanyag segítségével történő kimutatására

WESTERN BLOT Western blot SDS-PAGE Membrán Az egyik leggyakrabban alkalmazott olyan módszer a molekuláris biológiában amiben ellenanyagokat használnak SDS-PAGE gél  a minta fehérje komponenseinek elválasztása molekulatömegük alapján (átfedés is lehetséges) Membránhoz való hibridizálást követően a vizsgált fehérje kimutatása specifikus ellenanyaggal történik Fehérje detektálás specifikus ellenanyag-epitóp kölcsönhatás alapján Protein minta Standard Western blot SDS-PAGE Membrán

WESTERN BLOT Segítségével egy adott fehérje jelenléte kimutatható a mintában Az egymástól elektroforézissel elszeparált fehérjéket /Nátrium-Dodecyl Szulfát-Polyacrylamid Gélelektroforézis (SDS-PAGE)/, membránra transzferálják Primer ellenanyagot (monoklonális vagy poliklonális) használnak a vizsgált fehérje kimutatásához Enzimmel (pl. torma-peroxidáz) konjugált szekunder ellenanyag segítségével mutatják ki a primer ellenanyag kötődését

WESTERN BLOT Kimutatási eljárások: Kolorimetriás (peroxidáz enzim – denzitometria / spektrofotometria) Kemilumineszcens (ECL) Radioaktív (izotóp – RTG) Fluoreszcens (jelölés – CCD camera) 6

MEGNÖVELT KEMILUMINESZCENCIA /Enhanced chemiluminescence (ECL)/ H2O2 jelenlétében a torma-peroxidáz (HRP) oxidálja a diacilhidrazidokat (pl luminol) Az oxidáció hatására a luminol gerjesztett állapotba kerül és egy fotont bocsát ki, hogy visszatérjen az alapállapotba A kibocsátott foton fényérzékeny filmmel, vagy kamerával detektálható A fénykibocsátás fenol vázzal rendelkező molekulák (pl 6-hidroxi-benzothiazol) jelenlétében körülbelül 1000-szeresére növelhető (enhancer) Immobilizált proteinek Primer ellenanyag Fab Fc Torma- peroxidáz luminol H2O2 h Epitóp a protein felszínén luminol enhancer H2O detektálás Szekunder ellenanyag Membrán

Vizsgálandó citokin tartalmú oldat CYTOKIN ARRAY Sokféle citokin gyors meghatározására alkalmas különféle kikötött specifikus ellenanyagok Jelzett ellenanyagok keveréke Vizsgálandó citokin tartalmú oldat ( + ) IL-2 IL-4 … MIP3β … IFN Az ellenanyag általában enzimmel (peroxidáz) konjugált. A láthatóvá tétel alapul kemolumineszcencián, a WB-hoz hasonlóan Szendvics ELISÁval analóg módszer – a membrán egy-egy foltja az eliza lemez egy-egy lukának felel meg Mennyiségi meghatározás – inkább az egyes citokinek relatív mennyiségét lehet meghatározni vele … ( - ) Hátrány – a nagy felület miatt viszonylag nagy térfogatú/hígított mintára van szükség

Réthi és mtsi. 2006

IMMUNHISZTOKÉMIA Jelzéssel ellátott, antigén-specifikus ellenanyag mutatja meg az antigént a szövettani metszetben, vagy a sejtszuszpenzióban Immunfluoreszcencia fluoreszcensen jelzett ellenanyag FITC – fluoreszcein izotiocianát (zöldessárga) PE – fikoeritrin (narancssárga) Immunoenzim módszer enzimmel konjugált ellenanyag P – peroxidáz AP – alkalikus foszfatáz (a szubsztrátból oldhatatlan, színes csapadékot képeznek) A grafikonokon a ellenanyaghoz konjugált FITC és az R-fikoeritrin (R-PE) emissziós spektruma látható. (Hullámhossz az x tengelyen, emitált fény intenzitás az y tengelyen. A zöld és sárga sáv a FITC és PE detektálásához általánosan használt fényszűrők hullámhossz szélességét szimbolizálja)

IMMUNHISZTOKÉMIA Festés előtti metszet FIXÁLÁS METSZÉS Szövetminta FAGYASZTÁS

Sejtek (sejttenyészetek) IMMUNHISZTOKÉMIA Enzim Biotin Avidin Szekunder antitest Primer antitest Tárgylemez Sejtek (sejttenyészetek) Szövetmetszet

Hagyományos hisztokémia Hagyományos hisztokémiával csak kevés sejttípust tudunk azonosítani Hagyományos hisztokémia Akut bronchopneumonia (hematoxilin-eozin festés) Viszonylag kevés sejttípus azonosítható

(CD68+ makrofágok és limfociták által képzett granulóma) CD68 – különféle leírások szerint sokféle immunsejt expresszálja (B, T, DC, Granulociták, MF) Intracelluláris expresszió!!! szöveti metszetekben gyakran használják makrofág azonosításra CD68 is a glycoprotein which binds to low density lipoprotein. (LDL-R) Immunhisztokémia (CD68+ makrofágok és limfociták által képzett granulóma)

Antinukleáris (ANA) ellenanyagok kimutatása SLE-s személy szérumából, sejtkultúrában (Hep-2), immunofluoreszcencia segítségével (indirekt jelölés)

Aktin mikrofilamentek kimutatása (TRITC) TRITC konjugált anti-aktin ellenanyagokal Aktin mikrofilamentek kimutatása (TRITC) Lehetőség van részletes morfológiai információk kinyerésére (lásd a további ábrákat is)

Fixált és permeabilizált bőr fibroblaszt Mitochondrium F-actin Sejtmag Fixált és permeabilizált bőr fibroblaszt. A mitokondriumok kimutatásához egér IgG-t (anti–OxPhos Komplex V) és Alexa Fluor 555 festékkel konjugált kecske anti-egér IgG-t használtak. Az F-actin jelölése Alexa Fluor 488 festékkel konjugált phalloidinnel (gombatoxin) történt, a sejtmagot TO-PRO-3 jodiddal festették meg. falloidin – gombaméreg, ciklopeptid (duplagyűrűs heptapeptid) polimer aktint köt, aktin depolimerizációt gátol Fixált és permeabilizált bőr fibroblaszt Mitochondrium F-actin Sejtmag

Fixált és permeabilizált tüdőartéria endothel sejt Peroxiszómák kimutatása fixált és permeabilizált endotél sejtben (pulmonáris artéria). A peroxiszómák detektálásához peroxiszómális membrán protein 70 elleni monoklonális egér ellenanyagot és Alexa Fluor 488 festékkel jelölt kecske anti-egér IgG-t használtak. A mitokondriumokat MitoTracker Red festékkel jelölték meg a fixálás előtt; a sejtmag kimutatása DAPI festékkel történt. Fixált és permeabilizált tüdőartéria endothel sejt Peroxiszóma Mitochondrium Sejtmag

ÁRAMLÁSI CITOMETRIA A fluoreszcens mikroszkópiához hasonlóan az immunofluoreszcenciai módszerek eszköztárába tartozik, használatuk kiegészíti egymást Folyékony közegben, nagy sebességgel áramló egyedi sejteket, partikulumokat vizsgál A fluoreszcens festékkel jelölt sejtek által kibocsátott fény intenzitását és a sejtek fényszórását detektálja Rendkívül nagy számú sejt egyedi vizsgálatára alkalmas (akár több millió sejt percek alatt)

AZ ÁRAMLÁSI CITOMETRIA MINT AZ IMMUNRENDSZER VIZSGÁLATÁNAK ADEKVÁT ESZKÖZE Az immunrendszer sejtjeinek többsége nem vagy csak lazán kötött formában található, könnyen sejtszuszpenzióba vihető, fluoreszcens antigén specifikus ellenanyagokkal jelölhető és sejtenként vizsgálható. A nagyszámú sejt fényszórási és immunfluoreszcens sajátságai statisztikailag értékelhetők. (pl. sejtpopulációk százalékos aránya) Kis százalékban jelenlevő sejttípusok vizsgálatára is alkalmas (pl. adott antigénre specifikus limfociták, ritka sejtpopulációk vizsgálata) Az immunfluoreszcens jellemzők nem csak kvalitatív, hanem kvantitatív eredményekkel is szolgálhatnak – nem csak egy antigén jelenlétére, hanem annak mennyiségére és így egyes kezelések utáni mennyiségi változására is következtethetünk belőle. (pl. sejtaktivációt kísérő változások, betegségek progressziójának nyomon követése)

szorter-áramlási citométer asztali áramlási citométer FACS = Fluorescence-Activated Cell Sorting szorter-áramlási citométer (FACS)

FÉNYSZÓRÁS ÉS FLUORESZCENCIA Kis szögben szóródó fény detektora (FSC-forward angle light scatter szenzor) Többé kevésbé a vizsgált partikulumok, sejtek méretével arányos Lézer fluoreszcencia detektorok oldal irányú fényszórás (SSC-side scatter) detektora – a sejtek granuláltságát jellemzi A több színű festések lehetővé teszik sejtek alpopulációinak azonosítását is (autofluoreszcencia - piridinek és flavinok jelenléte miatt)

A perifériás vérben jelenlévő fő limfocita populációk A mérés elve egy példán keresztül: A CD4+ (helper) és a CD8+ (citotoxikus) T-sejtek arányának Meghatározása perifériás vérben (pl. AIDS progresszió nyomon követése) Jelölő anyagok: FITC jelzéssel ellátott anti-CD4 ellenanyag (α-CD4-FITC) PE jelzéssel ellátott anti-CD8 ellenanyag (α-CD8-PE) Th NK Tc B (az NK sejteken is lehet kis számú CD8) A perifériás vérben jelenlévő fő limfocita populációk Fluoreszcens mikroszkóppal valami ilyesmit látnánk

nagy sebességű folyadékáram A CD4-FITC jelölt (TH) sejt (küvettában, vagy szabadon) A CD4-FITC jelölt (TH) sejt detektálása jelfeldolgozó egység Képernyő detektor CD8 PE növekvő fényintenzitás Fókuszált lézernyaláb A CD4+ CD8- sejtet szimbolizáló pont mikroszkóppal: CD4 FITC

A CD8-PE jelölt (Tc) sejt detektálása jelfeldolgozó egység detektor CD8 PE növekvő fényintenzitás CD4 FITC

A jelöletlenül maradt sejtek detektálása (pl. B-sejtek) jelfeldolgozó egység detektor CD8 PE növekvő fényintenzitás mikroszkóppal halványnak látszó (autofluoreszcens) sejt CD4 FITC

kvadráns statisztika 18% 0% CD8 PE 44% CD4 FITC 38% A statisztikai adatok mérés közben is megtekinhetők 44% CD4 FITC 38%

ÁBRÁZOLÁSMÓDOK 1. dot-plot contour- plot density- plot A „plot”-ok a különféle sejtek százalékos megoszlása bemutatásának eszközei. A klasszikus dot-plotban egy-egy pont egy-egy sejtet reprezentál. Az NKT sejtek (CD4+ CD8+) összeköttetést biztosítanak a veleszületett és a szerzett immunválasz között. Ezek a sejtek APC-k CD1d receptoraihoz kötött glikolipid antigéneket ismernek fel TCR-ukkal. Aktivációt követően gyorsan és nagy mennyiségben választanak el citokineket és kemokineket (IFNg, IL-2, IL-4, TNFa, GM-CSF). Hiányukban több betegség is kialakulhat (pl. autoimmun betegségek, tumorok).

ÁBRÁZOLÁSMÓDOK 2. Hisztogramm A hisztogramm felfogható egy oldalról megtekintett kontúrplotként is. Ugyan sok esetben a hisztogrammokkal is lehet százalékos megoszlást bemutatni, de inkább a „festődés” mértékének (a kimutatandó sejtfelszíni molekulák mennyiségének) összehasonlítására való egyes minták közt. (Homogén sejtpopuláció hisztogrammja a normál eloszlásnak megfelelő) Az intenzitás értékek számszerűsíthetőek: ~ 7 ~ 1300

A KÜLÖNBÖZŐ SEJTTÍPUSOKNAK JELLEGZETES FÉNYSZÓRÁSUK VAN granulociták oldal irányú fényszórás (SSC) (pl.granuláltság) monociták A fényszórásnak sajátos fizikai törvényszerűségei vannak (hullámhossz, szóró anyag sajtságai, mérete stb. - fizikusok világa) Perifériás vér mononukleáris sejtjeinek fényszórása (a vizsgálatot zavaró eritrociták elötte lizálva lettek) Látható, hogy a granulált sejteknek milyen nagy az oldal irányú fényszórásuk (SSC). A granulált sejtek előre irányuló fényszórása (FSC) is nagyobb a granulálatlanoknál, de kevésbbé nyilvánul meg az oldalszóráshoz képest. Az FSC nagysága ezért csak hasonló granuláltságú sejtek esetében ad támpontot a méret összehasonlítására. limfociták előre irányuló fényszórás (FSC) („méret”)

PERIFÉRIÁS VÉR VIZSGÁLATA HEMATOLÓGIAI AUTOMATÁVAL Mért paraméterek: peroxidáz festés (mieloperoxidáz jelenléte, x – tengelyen) fényszórás (nagy granulált sejteknél magas, y –tengelyen) 1 Zaj 2 Magvas vörösvérsejt 3 Összetapadt thrombociták 4 Limfociták és bazofilek 5 Nagy nemfestődő sejtek (LUC) 6 Monociták 7 Neutrofilek 8 Eozinofilek Quantitatív vérkép készítése áramlási citométerrel mieloperoxidáz van az eozinofil, neutrofil granulocitákban és a monocitákban – megfelelő szubsztráttal festődnek a sejtek, ezt érzékeli a hematológiai automata. Nagy nem festődő sejtek (LUC): • Aktivált lymphocyták • Plazmasejtek • Hajas sejtek • Gyermekkori nagy lymphocytak • Myeloperoxidáz negatív blasztok • Myeloperoxidaz negativ neutrophil granulocyta Csak a főbb sejtípusokat lehet meghatározni vele

AZ IMMUNRENDSZER SEJTJEINEK JELLEMZÉSE SEJTFELSZÍNI ANTIGÉNEK ALAPJÁN Az egyes sejttípusoknak jellemző sejtfelszíni antigén „mintázata” van. Diagnosztikus értékű lehet: a sejttípusok jellemző százalékos arányának megváltozása rendellenes sejtfelszíni markerek megjelenése egyes markerek mennyiségének megváltozása, eltűnése Példák: gyulladásos folyamatok – neutrofil granulociták számának növekedése HIV progresszió, AIDS manifesztáció – CD4+ helper T-sejtek számának csökkenése CD4+ : CD8+ = 1.6 Normál CD4+ T-sejt szám = 600 – 1400/l HIV fertőzés  AIDS = CD4+ T-sejt szám <200/l (arány „átfordul”) - CD5+ B-sejtek felszaporodása – B-sejtes leukémiák egy része

IMMUNDEFFICIENCIÁK DIAGNOSZTIKÁJA ÁRAMLÁSI CITOMETRIÁVAL WAS: Wiscott-Aldrich Syndrome (WAS protein defektus) XLA: X-linked Agammaglobulinemia (Btk defektus) egyik tüneti jellemzője sok közül: CD43 expresszió alacsony v. hiányzik WAS - Wiscott-Aldrich Syndrome protein (WASP) defektusa (hiány vagy működészavar). A CD43 hiány csak egy a sok diagnosztikus marker közül és önmagában valószínűleg kevés a WAS diagnózisához This protein is expressed by hematopoietic cells and appears to play a role in actin polymerization and cytoskeleton arrangement. The mutations are associated with either lack of synthesis or with synthesis of an abnormal WASP. In the absence of functional WASP, hematopoietic cells demonstrate abnormal size, shape, and function that is most apparent in platelets and lymphocytes. XLA – Btk - Bruton tirozin kináz defektusa miatt jön létre, pre-B-sejt szinten megrekednek a sejtek B-sejtek fejlődésének megrekedése egyik jellemző tünet: CD19+ B-sejtek hiánya

CD antigén sejttípus funkció ligand T-sejtek T-sejt antigén receptor jelátvivő része (Intracelluláris kináz, foszfatáz) CD4 helper T-sejtek, (monociták, pDC) T-sejt antigénreceptor koreceptora, (HIV receptor) MHC- II, HIV CD5 T-sejtek, (B-sejt alpopuláció: B1) sejt adhézió, jelátvitel (kostimuláció) CD72 CD8 citotoxikus T-sejtek, (NK,  T-sejt alpopuláció) T-sejt antigénreceptor koreceptora MHC I CD14 Monociták, makrofágok, granulociták egy része LPS receptor része LPS, LBP CD19 B-sejtek CR2 része, B-sejt antigénreceptor koreceptora C3d, C3b CD28 kostimuláció (B7-1, B7-2) CD80, CD86 CD34 hematopoietikus progenitor sejt (endothel sejtek) sejt adhézió CD62L (L-szelektin) CD56 NK-sejtek, (T és B-sejt alpopuláció) homoadhézió (N-CAM izoform) CD80, CD86 (B7-1, -2) professzionális APC: DC, B, monocita, makrofág kostimuláció, sejt adhézió CD28, CD152 LPS – lipopoliszaharid LBP – lipopoliszacharid kötő fehérje CR2 – komplement receptor 2 (liganduma: C3d és C3b) (A C3d a C3b-ből keletkező fragment. Nem enzimaktív, de nagyon hatékony opszonin)

Szerzett immunhiányos szindróma (Acquired Immune Deficiency Syndrome – AIDS) Bizonyos betegségek az immunrendszer szupresszióját, vagy működésének zavarát okozhatják. A XX. század elején, amikor a tuberkulózis volt a legfőbb halálok, s a népesség 50%-a tuberkulin-pozitív volt, jól ismert volt az a tény, hogy egy egyidejű kanyarófertőzés az egyébként problémamentes TB-fertőzés hirtelen súlyosbodásához és halálhoz vezethet. A pontos mechanizmust mára tisztázták: az immunszupresszió hátterében az IL-2 szintézis csökkenése áll, miután a kanyaró vírus a makrofágok CD46 vagy a SLAM receptorához kötődött.

Az immunválaszra gátló hatást kifejtő mikroorganizmusok egy része a limfocitákat fertőzi. A HIV (Human Immunodeficiency Virus) ijesztő példája annak, hogy milyen következményekkel jár, ha az immunsejteket egy mikroorganizmus megfertőzi és elpusztítja. A HIV receptora a T-sejtek felszínén lévő CD4 molekula. A CD4 molekula a makrofág típusú sejtek felszínén is expresszálódik, így a vírus ezeket a sejteket is képes megfertőzni. A klinikai lappangás ideje hosszú, általában több év. Ezalatt mind a CD4+ sejtek, mind a vírusrészecskék gyorsan pusztulnak és újratermelődnek. Amikor a CD4+ sejtek nagyobb arányban pusztulnak el, mint ahogy a szervezet képes lenne regenerálni őket, számuk olyan alacsony értéket vesz fel, hogy a sejtközvetített immunitás működésképtelenné válik. A sejtközvetített immunválasz hiányában a gazdaszervezet halálos kimenetelű opportunista fertőzések áldozatául eshet.

A Pinkerton-család: fertőzött vér okozta tragédia ESETTANULMÁNY: A Pinkerton-család: fertőzött vér okozta tragédia Benjamin Pinkerton az USA haditengerészetének századosa volt és Japánban teljesített szolgálatot. A szolgálati idő alatt feleségül vett egy japán nőt, aki 1987-ben két egészséges leánygyermeket szült. Négy évvel később született egy fiú is, aki szintén egészségesnek tűnt. A fiú öt hónapos korában megkapta a diftéria toxoiddal, valamint pertusszisz baktériummal és tetanusz toxoiddal (DPT), továbbá orális poliovakcinával végzett rutin immunizálást. Ezeknek az oltásoknak nem volt mellékhatásuk és a gyermek jól fejlődött. Hathónapos korában megbetegedett és fogyni kezdett. Súlyos, tartós hasmenés lépett fel, amely lázzal járt. Szájüregében szájpenész terjedt, és gyors egymásutánban kétszer esett át középfülgyulladáson. A haditengerészet kórházának orvosai többször vizsgálták a fiút és antibiotikum kezelést írtak fel, ami hatástalannak bizonyult. A fizikai vizsgálat eredményei: testhőmérséklet 38oC szájpenész a nyelv oldalsó felszínén és a száj belső oldalának nyálkahártyáján (candidiasis) pelenkakiütés, melyet szintén Candida fertőzés okozott belégzéskor mindkét tüdőfélben finom, szörtyögő zaj hallatszott

Laborvizsgálatok: normális fehérvérsejt-szám (6500/ml); az egyes fehérvérsejtek aránya szintén normális volt (neutrofilek 62%; limfociták 30%; monociták 5%; eozinofilek 2%; bazofilek 1%); normális immunglobulin szintek: szérum IgG: 997 mg/dl (fiziológiás: 800-1000 mg/dl); szérum IgM: 73 mg/dl (fiziológiás: 50-150 mg/dl); IgA: 187 mg/dl (fiziológiás: 150-300 mg/dl); a limfociták vizsgálata során normális mennyiségű CD8+ T-sejtet találtak, míg a CD4+ T-sejtek aránya nagyon alacsony volt, mindössze 85/ml (fiziológiás: 1000-1200/ml); intradermális Candida antigén nem váltott ki késői típusú hiperszenzitivitási reakciót; a szérumban ELISA módszerrel és Western blot technikával HIV elleni antitesteket mutattak ki

Orális candidiasis nyelőcsövi candidiasis

Gombafertőzés okozta pelenkakiütés

ELISA Western blot VIZSGÁLATI MÓDSZER VIZSGÁLT FEHÉRJÉK MINTA DETEKCIÓ Anti-HIV IgG ill. IgM antitestek szérum (esetenként vizelet vagy nyál is) másodlagos (conjugate-) anti-humán IgG antitestekkel Western blot HIV burokfehérjék: gp41, gp120, gp160; Core: p17, p24, p6, ill. p7 A HIV-diagnosztika során elsőként mindig ELISA-módszerrel vizsgálják a mintákat. Pozitív eredmény (reaktív szérum) esetén két további vizsgálat szükséges (2. és 3. vizsg.). Ismételt reaktivitás esetén az egyén mintáját verifikálják: leggyakrabban Western blot - os mérést, vagy újabb ELISA - mérést végeznek. E felismerést követően a fenti módszerekkel ellenőrizték a szülőket is: mind az apa, mind az anya HIV-antitestre pozitívnak bizonyult.

vége felé a magzat meghalt, s császármetszéssel kellett eltávolítani. Míg Pinkerton százados jó egészségnek örvendett, felesége gyengélkedett és állandó hőemelkedésről és a nyaki nyirokcsomók duzzanatáról panaszkodott. Kiderült, hogy a fiúgyermek születése előtt két évvel a nő terhes volt. A terhesség vége felé a magzat meghalt, s császármetszéssel kellett eltávolítani. A nő jól viselte a műtétet, de a vérveszteség miatt vérátömlesztésre volt szükség, mely során 2 egység vért kapott. A gyermek egymás után két súlyos Pneumocystis carinii illetve Pseudomonas aeruginosa fertőzésen esett át. Súlyos köhögés alakult ki nála, amely során véres köpet termelődött (hemoptysis). Egy héttel később meghalt. A szülők AZT- (zidovudin) terápiában részesültek. A nő később szintén légzési elégtelenségben életét vesztette, míg a százados – magas HIV-antitest szintje ellenére – egyelőre tünetmentes maradt. highly active antiretroviral therapy – HAART a vírus életciklusának különböző pontjain különféle folyamatokra ható szerek kombinációja (2 reverz transzkriptáz inhibitor, 1 proteáz inhibitor, itegráz inhibitorok, „entry” inhibitorok,) lehetnek szinergista hatásúak is – kisebb dózis is elegendő, kevesebb mellékhatás