FUNKCIONÁLIS DOMAIN-EK BIM BSc 2007 AKTIVÁLT KOMPLEX ES* FUNKCIONÁLIS DOMAIN-EK SZUBSZTRÁT KÖTŐ HELY REGULÁTOR DOMAINEK: Me modulátor (INHIBITOR,AKTIVÁTOR,S,P) Kovalens módositás: foszforilezés glikozilezés proteolizis Katalitikus domain AKTIV CENTRUM lehetnek azonosak is

ENZIM MODULÁCIÓ

REVERZIBILIS IRREVERZIBILIS INHIBÍCIÓ REVERZIBILIS IRREVERZIBILIS E + S ES E + P + I E I DINAMIKUS EI KOMPLEX LINEÁRIS INHIBÍCIÓ komplett kP NEMLINEÁRIS INHIBÍCIÓ (HIPERBOLIKUS) részleges βkP „csökkent, maradék aktivitás” 1/V - I ábrázolás DIXON ábrázolás

Irreverzibilis inhibitorok Di-izopropyl-foszfofluoridát: sarin ideggáz prototípusa Irreverzibilisen inaktiválja az acetilkolinészterázt ( ser-proteázokat) a Ser195-tel kovalensen kötödve (aktív centrumban) Hasonlók: Malathion , ethyl parathion (szerves foszfát peszticidek)

MODELLEK 1. KOMPETITÍV INHIBÍCIÓ 1. I szubsztrát analóg VERSENGÉS S ÉS I KÖZÖTT AZ E AKTÍV HELYÉÉRT, VAGY..... KÖLCSÖNÖS KIZÁRÁS I szubsztrát analóg alternatív szubsztrát termék MODELLEK S I MODELL: Klasszikus kompetitív inhibíció Az I verseng S-sel ugyanazon aktív hely elfoglalásáért

MODELLEK S I 1. KOMPETITÍV INHIBÍCIÓ 2. 2. MODELL: sztérikus gátlásA : I kötődése egy másik kötő helyhez térbelileg gátolja S-nek az aktív helyhez kötését.

MODELLEK I S 1. KOMPETITÍV INHIBÍCIÓ 3. 3. MODELL: sztérikus gátlás B : I és az S verseng egy közös kötő helyért.

MODELLEK S I 1 2 3 4 1. KOMPETITÍV INHIBÍCIÓ 3. BIM SB 2001 MODELLEK S I 1 2 3 4 4. MODELL: átlapoló helyek esete :1 és 3 kötő hely képes az i, a 2 és 4 kötő hely pedig az S megkötésére, de egymást kölcsönösen kizárják

MODELLEK 1. KOMPETITÍV INHIBÍCIÓ 4. S S I I S 5. MODELL: I kötõdése az enzimhez konformáció változást okoz az enzimen és ez megakadályozza S-nek az aktív centrumhoz kötődését. Ilyen a végtermék gátlás (feed back inhibíció) is.

1. KOMPETITÍV INHIBÍCIÓ 5.

1. KOMPETITÍV INHIBÍCIÓ 6.

1. KOMPETITÍV INHIBÍCIÓ 7. Adott S-nél melyik az az I, amelyik 50%-os inhibíciót okoz?

1/V I a = tg S= ¥ , tg =0 -K DIXON ábrázolás: ÷ ø ö ç è æ + S K 1 V max a = tg S= ¥ , tg =0 -K 1/Vmax

S S= ¥ 1/V a = tg S K V tg a =0 -K I ÷ ø ö ç è æ + S K 1 V 1/Vmax i I I I

1. KOMPETITÍV INHIBÍCIÓ 8. S- analógok ALTERNATÍV SZUBSZTRÁTOK : HEXOKINÁZ: glükóz, fruktóz S- analógok KEMOTERÁPIA

p-NH2-benzoesav 1. KOMPETITÍV INHIBÍCIÓ 8. PABA átalakulás fólsavvá KEMOTERÁPIA FÓLSAV (baktérium számára szükséges) PABA analóg blokkolja a fólsav szintézist szulfa- metoxazol

Gl-6P-dehidrogenáz (1.1.1.49) S= G6P/NADP inh: PO4 Ki = 10-1 mmol/l Szukcinát-dehidrogenáz(1.3.99.1) S= szukcinát fumarát Ki = 1,9.10-3 mmol/l

alternativ v. versengő szubsztrátok k. termék inhibició ANALÓGIÁK kompetitiv inhibició alternativ v. versengő szubsztrátok

2. NEMKOMPETITÍV INHIBÍCIÓ KS KI KI KS V = kp(ES)

Az inhibitor az enzimnek egy másik kötő helyéhez kapcsolódik és nem befolyásolja a szubsztrát kötődését -- nem változtatja meg az enzimnek a szubsztráthoz való affinitását. Csak a rapid ekvilibrium körülményei között létezik, Ks=Km.

2. NEMKOMPETITÍV INHIBÍCIÓ 2. Az inhibitor a látszólagos Vmax értéket változtatja meg, Ks (illetve Km) értékét nem befolyásolja.

2. NEMKOMPETITÍV INHIBÍCIÓ 3. tg  Km/Vmax -KI I

2. NEMKOMPETITÍV INHIBÍCIÓ: Dixon

2. NEMKOMPETITÍV INHIBÍCIÓ 4. Mekkora I duplázza meg a L-B egyenes meredekségét? Mekkora I okoz 50%-os inhibíciót? I = KI Példák: H+ ionok hatása a kimotripszin esetében. Itt az aktív centrumban egy proton akceptor hely van, amely inhibeálható növekvő H+-ion koncentrációval. (A L-B ábrázolás tiszta nemkompetitív inhibíciót mutat, azonban ne feledkezzünk meg a pH-nak komplex enzimbefolyásoló hatásáról ). nehézfém molekulák (-SH reagensek), vagy cianidok. Ezeknél azonban a hatás gyakran irreverzibilis Kreatinkináz (2.7.3.2) S= kreatin/ATP inhibitor: ADP Ki =2.10-3 Fruktóz-bifoszfatáz (3.1.3.11) S=Dfr-1,6biP AMP Ki =1,1.10-4

ALMASZELET levegőn barnulás:o-diphenol oxidase katechin-oxidáz katechin → o-kinon (hasonló enzim: tyrosinase tyrosine → melanin.) ez tovább oxidálódik barna termékekké kompetitiv inhibitor: para-hydroxybenzoesav (PHBA) (B), ugynoda kötődik,mint a katechin nonkompetitiv inhibitor: phenylthiourea rézhez kötődik, ami elengedhetetlen az enzimműködéshez

3. UNKOMPETITÍV INHIBÍCIÓ 1 I csak az ES-hez kötődik I kötő hely „nem kész” Ks kp I kötő hely „ kész” Ks kp E + P E + S ES + I ESI S kötő hely eltorzult

3. UNKOMPETITÍV INHIBÍCIÓ 2 mi változott? l.nemkomp.inh. a komp forditottja, KS csökken Egy unkompetitiv I KS és Vmax értékét ugyanolyan mértékben csökkenti

3. UNKOMPETITÍV INHIBÍCIÓ 3

3. UNKOMPETITÍV INHIBÍCIÓ 4 DIXON ábrázolás 1/V = f( I ) minden inh. esetében ismert: LINEÁRIS INH. 1/V S nő I

Lansoprazole, a known H+/K+-ATPase inhibitor, is currently used as a therapeutical option for the initial treatment of gastroesophageal reflux disease. Recently, lansoprazole has been found to be an inhibitor of cytosolic PHOSPHO1 (a phosphatase which hydrolyses phosphocholine and phosphoethanolamine), providing a possible therapeutical target to cure pathological mineralization. Since PHOSPHO1 is present inside matrix vesicles, we tested the effect of lansoprazole on matrix vesicles containing several key enzymes for the mineralization process including tissue-nonspecific alkaline phosphatase. We found that lansoprazole can inhibit in an uncompetitive manner tissue-nonspecific alkaline phosphatase. A Ki value of 1.74±0.12 mM has been determined for the inhibition of tissue-nonspecific alkaline phosphatase by lansoprazole. Lansoprazole, currently used for treating gastroesophageal disease, by inhibiting PHOSPHO1 and tissue-nonspecific alkaline phosphatase could prevent hydroxyapatite-deposition disease and could serve as an adjunct treatment for osteoarthritis.

Unkompetitiv inh: alkalikus foszfatáz inhibiciója fenilalanin által Placenta alkalikus foszfatázát L-Phe unkompetitive gátolja

At alkaline pH, alkaline phosphatase catalyzes the release of inorganic phosphate from phosphate esters. It is found in a number of tissues, including liver, bile ducts, intestine, bone, kidney, placenta, and leukocytes. Alkaline phosphatase plays a role in the deposition of hydroxyapatite in osteoid cells during bone formation. The function of alkaline phosphatase in other tissues is not known. Serum alkaline phosphatase levels are important diagnostic markers for bone and liver disease.

I JELENLÉTE MÓDOSITJA S-NEK ES-RŐL TÖRTÉNŐ DISSZOCIÁCIÓJÁT KEVERT TIP. INHIBICIÓ K S k P E + S ES E + P l. nemkomp!!! DE + + ahol K =E.S/ES, I I S a K =EI.S/ESI a K S K I I a K S K =E.I/EI I EI + S ESI a K =ES.I/ESI I I JELENLÉTE MÓDOSITJA S-NEK ES-RŐL TÖRTÉNŐ DISSZOCIÁCIÓJÁT E ES ESI E EI ESI

LINEÁRIS KEVERT TIP. INHIBICIÓ 2 L. NEMKOMP!!!

LINEÁRIS KEVERT TIP. INHIBICIÓ 3

INHIBICIÓK ÖSSZEFOGLALÁSA S és I kölcsönösen kizárják egymást az enzimről KOMPETITIV S és I egymástól függetlenül kötődnek az enzimre NEMKOMPETITIV mint előző, de az I megváltoztatja az enzim affinitását KEVERT TIPUSÚ I csak a S után kötődik UNKOMPETITIV

nemkompetitív kompetitív unkompetitív kevert

LINEWEAVER-BURK ÁBRÁZOLÁS KOMPETITIV INHIBICIÓ NEMKOMPETITIV INHIBICIÓ UNKOMPETITIV INHIBICIÓ KEVERT TIPUSÚ INHIBICIÓ I

Hanes – Langmuir ábrázolás NEMKOMPETITIV INHIBICIÓ S/V S -Kmapp -Km KOMPETITIV INHIBICIÓ I UNKOMPETITIV INHIBICIÓ KEVERT TIPUSÚ INHIBICIÓ

EADIE- HOFSTEE ábrázolás V/S V Vmax I KOMPETITIV INHIBICIÓ NEMKOMPETITIV INHIBICIÓ Vmaxi UNKOMPETITIV INHIBICIÓ KEVERT TIPUSÚ INHIBICIÓ

Sok S molekula → egy S molekula az egyik, SZUBSZTRÁT INHIBICIÓ -- A szubsztrátnak ahhoz, hogy termékképző átmeneti komplex jöjjön létre, két vagy több helyen kell, hogy az enzimhez kötődjék. Sok S molekula → egy S molekula az egyik, másik S molekula pedig egy másik kötőhelyhez kapcsolódik s így inaktív komplexek jönnek létre (ez is reverzibilis inhibíció). E -OOC CH2 CH Borostyánkősav Malonsav -OOCCH2CH2COO- Normális kapcsolódás S-inhibíció

SZUBSZTRÁT INHIBICIÓ ■-- Nagy S koncentrációnál egy S molekula olyan kötőhelyhez is kapcsolódhat az enzimen, amely nem az aktív centrum része, az ilyen kötődés mintegy NEMKOMPETITIV (v. unkompetitiv) módon megakadályozza a normális S kötődést. ■--Az enzim működéshez szükség lehet egy AKTIVÁTOR molekulára. Ha ez kapcsolódni képes a szubsztráttal, sok S molekula "elvonja" az enzimtől az aktivátort, így csökkentve annak tényleges aktivitását. ■--Két (vagy több) szubsztrátos reakciók esetén az egyik szubsztrát feleslege lekötheti a másik szubsztrát kötő helyeit, megakadályozva a szükséges második szubsztrát kapcsolódását, így megintcsak inaktív komplexek jönnek létre. ■-- Nagy S koncentráció aspecifikus módon is gátolhatja a reakciót, például az ionerősség megnövekedése miatt.

SZUBSZTRÁT INHIBICIÓ b és c -- disszociációs állandó megváltozását mérő faktorok egyszeres S kötés esetén, a -- kölcsönhatási együttható rendszerint > 1

SZUBSZTRÁT INHIBICIÓ

V max 1 K m /V S 1/S 1/V

Az uncompetitiv inhibició SZUBSZTRÁT INHIBICIÓ Az uncompetitiv inhibició sémájából I=S, tehát Ks kp E + S ES E + P + S Ki SES ha [S] kicsi ha [S] nagy

Szubsztrát koncentráció (mg/L) SZUBSZTRÁT INHIBICIÓ 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 50 100 150 200 250 300 Vmax=0.9,Ks=50,Ki=10 Vmax=0.9,Ks=50,Ki=50 Vmax=0.9,Ks=50,Ki=100 Szubsztrát koncentráció (mg/L) V