Plazmid tartalmú mikrobák tenyésztése és kinetikája BIOREAKT 2009_MSc Genetikailag manipulált mikroorganizmusok (GMO)idegen-fehérje termelésének egyik.

Slides:



Advertisements
Hasonló előadás
Utazás a sejtben Egy átlagos emberi sejt magja megközelítőleg 510-15 gramm mennyiségű és 1,8-2 méter hosszúságú (3000 millió bázispárnyi) DNS-ből,
Advertisements

BIOTECHNOLÓGIA D MsC gyakorlat
1 Az obnyinszki atomerőmű indításának 50. évfordulójára emlékező tudományos ülésszak június 25., Pécs Az atomenergetika gazdaságossága és versenyképessége.
Az éghajlatváltozás problémája egy fizikus szemszögéből Geresdi István egyetemi tanár Pécsi Tudományegyetem Természettudományi Kar.
Mi az a mikroorganizmus?
Sejtjeink jellemzői 4. Lecke 8. osztály.
A munkapiac és az összkereslet
Elektroforézis Általában agaróz a hordozó
Génexpresszió más (nem-E.coli) prokariótában
A humán genom projekt.
A membrántranszport molekuláris mechanizmusai
C mIg H mIg L TCR  TCR  T-SEJT  C V Antigén receptor TCR A B- ÉS T-SEJTEK ANTIGÉN FELISMERŐ RECEPTORAI HASONLÓ SZERKEZETŰEK TCR =  +  A.
IPPI ÁLTALÁNOS ISKOLA SZILÁGY MEGYE
Lineáris programozás Modellalkotás Grafikus megoldás Feladattípusok
Információhordozó makromolekulák
LEPÁRLÁS (DESZTILLÁCIÓ) Alapfogalmak
A szervezet energiaforgalma
Ismételt fogolydilemma játék sztochasztikus reaktív stratégiákkal. 4
ÖSSZEFOGLALÓ ELŐADÁS Dr Füst György.
Matematikai alapok és valószínűségszámítás
Ahhoz, hogy dolgozni tudjunk égy adott génnel, vagy szekvenciával nagy mennyiségű DNS-re van szükségünk, ezért valamilyen módon „klónozni” kell, a gén.
MIÉRT NEM MÉRHETŐ? E + S P + E mol/dm3!!!!
Plazmidok Készítette: Vásárhelyi Miklós. : E. Coli jól használható genetikai kísérletekben: Genomja kicsi(4,2*10 6 bázispár, kb. ezrede az emberének)
Génmanipulált növények biztonsága Smeller Margit
FERMENTÁCIÓS GYAKORLAT
Készítette: Leidecker Orsolya
Elektroporáció.
Készítette: Kiss László
FERMENTÁCIÓS RENDSZEREK MATEMATIKAI MODELLEZÉSE
Készítette: Vancsó Ildikó
Vegyes kultúrák, mikrobiális kölcsönhatások
A moláris kémiai koncentráció
MIÉRT NEM MÉRHETŐ? E + S P + E mol/dm3!!!!
FERMENTÁCIÓS RENDSZEREK LEVEGŐELLÁTÁSA
FOLYTONOS FERMENTÁCIÓ
Növekedés és termékképződés idealizált reaktorokban
Egyéb fermentációs technikák
FOLYTONOS FERMENTÁCIÓ
A statisztikai próba 1. A munka-hipotézisek (Ha) nem igazolhatók közvetlen úton Ellenhipotézis, null hipotézis felállítása (H0): μ1= μ2, vagy μ1- μ2=0.
4. Ismertesse az aminosavak reszolválási módszereit.(5 pont)
Hőszállítás Épületenergetika B.Sc. 6. félév március 9. ISMÉTLÉS.
Hőtan.
NUKLEINSAVAK MBI®.
C mIg H mIg L TCR  TCR  T-SEJT  C V Antigén receptor TCR A B- ÉS T-SEJTEK ANTIGÉN FELISMERŐ RECEPTORAI HASONLÓ SZERKEZETŰEK TCR =  +  A.
Problémás függvények : lokális optimalizáció nem használható Globális optimalizáció.
Biológiai anyagok súrlódása
Két kvantitatív változó kapcsolatának vizsgálata
A P elemek mobilitásának szabályozása
A P elem technikák: enhanszerek és szupresszorok azonosítása
Az eukarióta sejtciklus szabályozása
A SEJTCIKLUS ÉS A RÁK KAPCSOLATA
A molekuláris evolúció neutrális elmélete
Oxidatív Stressz Hatása Vázizomsejtekre
A szervezet energiaforgalma
Populáció genetika Farkas János
A probléma gyökere: a szuperpozíció elve
Rekord statisztikák Készítette: Komjáti Bálint IV. évf. fizikus hallgató (ELTE-2006) Györgyi Géza: Extrém érték statisztikák előadásán tartott szemináriumára.
MSc 2012 ENZIMES ÖSSZEFOGLALÓ Egy egység az az enzim mennyiség, amely 1  mol szubsztrátot alakít át vagy 1  mol terméket képez 1 perc alatt adott reakció.
Mikrobasejtek ciklus alatti növekedése A tenyészet sejtszáma az idő függvényében N(t) = N 0 ·e  ·t (ha a külső környezet és a sejtek fiziológiai állapota.
Sejtek genetikai módosítása (gének bevitele vagy eltávolítása)
DNS szintézis, replikáció Információ hordozó szerep bizonyítéka Avery-Grifith kísérlet Bakterifágos kísérlet.
ÖKOLÓGIA.
Növekedés és termékképződés idealizált reaktorokban
The lactose (lac) operon - an example for prokaryotic gene regulation
Molekuláris biológiai módszerek
A szervezet energiaforgalma
Mikrobasejtek ciklus alatti növekedése
FOLYTONOS FERMENTÁCIÓ
Hőtan.
Előadás másolata:

Plazmid tartalmú mikrobák tenyésztése és kinetikája BIOREAKT 2009_MSc Genetikailag manipulált mikroorganizmusok (GMO)idegen-fehérje termelésének egyik esete a nagyszámú, idegen gént hordozó plazmid “tevékenység”, e sejtek nagysúlyú “hátizsákot” cipelnek magukkal, ezért lassabban növekednek mint a plazmidot nem tartalmazó sejtek, illetve a tápanyagokra (a limitáló szubsztrátra) vonatkozó hozamok is kisebbek a plazmidtartalmú sejtek esetén. Érthető ezért a plazmidvesztés nullánál nagyobb valószinűsége, illetve, hogy egy vegyes populációban - amelyben tehát plazmidos és plazmidmentes sejtek együtt fordulnak elő – a plazmid mentes sejtek túlnövik a plazmidtartalmú sejteket. plazmid mentesplazmidot tartalmazó ATP szükséglet97* mol/sejt163* mol/sejt Y ATP 10,3*10 13 db sejt/mol 29 g/mol 6,1*10 13 db sejt/mol 26 g/mol

Plazmidtartalmú mikrobák tenyésztése és kinetikája 1.Szegregációs instabilitás 2. Strukturális plazmid instabilitás 3. Gazdasejt mutációk 4. Növekedési sebességek különbözőség

Plazmidtartalmú mikrobák tenyésztése és kinetikája 1.Szegregációs instabilitás LCN (low copy number),  20 kópia/sejt speciális mechanizmus biztosítja a plazmidoknak a replikáció utáni egyenletes megoszlását a leánysejtekben. (par locus [partition] a plazmidon) HCN (high copy number), > 20 kópia/sejt plazmidok megoszlása az anya és leánysejtek között véletlenszerű binomiális eloszlást követ: ritkán rendszerint C= plazmid replikációs egységek száma

ritkán rendszerint Anyasejtek leánysejtek

Plazmidtartalmú mikrobák tenyésztése és kinetikája Példa 40 plazmid egységet tartalmazó sejt. Annak a valsége, hogy osztódáskor plazmidmentes sejt jön létre, P= 2 (1-40) = 1.8* plazmidnyi DNS fele dimer, ötöde pedig tetramer M+D+T =40 D = ½(40) = 20 monomer pl. -ekvivalens azaz 10 dimer T = 1/5(40) = 8 monomer pl. -ekvivalens azaz 2 tetramer M = =12 ténylegesen monomer plazmid együtt replikálódó egységek száma =24. P=2 (1-24) =1.2*10 -7, Sejtek felében 10 kópia, másik felében 70 (az átlag 40!) P= 0.5*P(0) *P(0) 70 =0.5*2 (1-10) +0.5*2 ( 1-70) =9.8* *  9.8* Az alacsonyabb kópiaszámú sejtek határozzák meg a plazmidszegregáció gyakoriságát!

Plazmidtartalmú mikrobák tenyésztése és kinetikája 2. Strukturális plazmid instabilitás. Sejten belüli rekombináció: plazmidon kódolt markerek, például az antibiotikum rezisztencia génje integrálódik a gazdasejt kromoszomális DNS- ébe, ugyanakkor plazmidon történő mutáció miatt a fehérjetermelés képessége megszűnhet. A marker megvan, azt hisszük, hogy – pl. antibiotikum adagolással - a szelekciós nyomás fenntartásával csak a plazmidhordozók fognak szaporodni, pedig mivel a fehérjét nem termelõ sejtek megszabadultak a metabolikus “hátizsáktól”, nagyobb fajlagos növekedési sebességük miatt éppen az ilyen rekombinánsok fognak felhalmozódni a tenyészetben. A sejten belüli rekombináció, és a plazmid mutáció együtt de külön-külön is az idegen fehérjét nem termelők feldúsulásához vezethet.

Plazmidtartalmú mikrobák tenyésztése és kinetikája 3. Gazdasejt mutációk - fehérjetermelés képességének a megszűnése. Ha például a fehérjeszintézis a Lac promoterhez kötött, és a Lac promoter mutációt szenved úgy, hogy a sejt nem rendelkezik ezután laktóz permeázzal, akkor a sejt nem lesz képes az induktor laktóz felvételére és nem lesz képes a fehérjetermelés beinditására. 4. Túlnövés: a gyorsabban szaporodó, idegen fehérjét nem termelő sejteknek a fajlagos növekedési sebességek különbözőségéből eredő túlnövése. (Ez az előző háromnak is mindíg következménye.)

Plazmidtartalmú mikrobák tenyésztése és kinetikája Plazmidstabilitás befolyásolása Molekuláris biológiai módszerekkel. *plazmid kópiaszám (50 felett általában stabil, E.colinál a legjobb eredmények nagyságú kópiaszám esetén ). *promoter erősségének fokozása ( a fehérjetermelés nagyságát meghatározó másik tényezõ) Leggyakrabban az IPTG-vel (izo-propil-  -D-tiogalaktozid) indukálható Lac promotert, illetve a hőmérséklet emeléssel (30-ról 42 o C-ra) indukálható pL promotert alkalmazzák. És... *szelekciós nyomás fenntartása: antibiotikum adagolás a plazmidtartalmú sejtek szaporodásának fenntartására Nem alkalmazható nagy léptékben: antibiotikum rezisztencia = antibiotikum lebontása ( állandóan kellene adagolni a drága antibiotikumot). * többlépcsős kemosztát és kétfázisú szakaszos fermentációs technika. pL promoter esetén a E.coli-t 30 o C-on tenyésztjük (esetleg antibiotikum jelenlétében) az exponenciális fázis végéig, a hanyatló fázis közepéig, majd megemeljük a hőmérsékletet 42 o C-ra. Ekkor a szaporodás gyakorlatilag leáll (lelassul) és a fehérjetermelés elkezdõdik.

*Kromoszómáról létfontosságú gén plazmidra → csak a plazmidosok életképesek. *Kisebb plazmidok stabilabbak, együttreplikálódók számának csökkentése *runaway replikációs plazmidok: 1/sejt →növekedés →indukció a plazmidreplikációra akár 800db/sejt →indukció a fehérjetermelésre. *

Plazmidtartalmú mikrobák tenyésztése és kinetikája LÉPTÉK HATÁSA INOKULÁLÁSI SOR: 1. FERDE AGAROS TENYÉSZET ml RÁZOTT LOMBIK l LABORFERMENTOR l KISÉRL. ÜZEM 5 50, ,000 l TERMELŐ ÜZEM INOKULUM legyen 3% % 100/3= 33 szoros növekedés Azaz minimális követelmény 5*5= 25 generáció! stabilitása

Plazmidtartalmú mikrobák tenyésztése és kinetikája Annak a valószínűsége, hogy a plazmidhordozó sejtekből ( X+) plazmidmentes jön létre: p. N o db sejtből N o (1-p) plazmidos és N o (p) plazmidmentes sejt születik. Az plazmidos sejtek száma a konszekutiv generációk során: 1.generációN o + N o (1-p) = 2 N o - N o p = N o (2-p) anya leány 2.generáció N o (2-p) + N o (2-p)(1-p) = N o (2-p) 2 3.generáció N o (2-p) 2 + N o (2-p) 2 (1-p) = N o (2-p) 3. n.generáció = N o (2-p) n Kinetikai viselkedés De: a plazmidmentesek is szaporodnak (sőt), bonyolult rekurzív formula!

Plazmidtartalmú mikrobák tenyésztése és kinetikája IMANAKA és AIBA (1981)Feltétel: az X arányos N-nel! Megoldható, ha μ és p állandó (l. Versengő specieszek esetét!!!)

Plazmidtartalmú mikrobák tenyésztése és kinetikája ! Ez a jó!!! Elsőrendű lineáris difegyenlet általános megoldása

Plazmidtartalmú mikrobák tenyésztése és kinetikája Bevezetés, definiíció:

Plazmidtartalmú mikrobák tenyésztése és kinetikája tenyésztés során keletkezett generációk száma n=  + t/ln2 plazmidhordozó sejtek metabolikus megterhelését mérő jelzõszám  =  - /  + a generációk számának, a plazmidvesztés valószínűségének, a metabolikus megterhelésnek a függvényében mutatja a plazmidhordozó sejthányad alakulását a tenyésztési idő (generációk) változásában.

Plazmidtartalmú mikrobák tenyésztése és kinetikája Plazmidhordozók hányada a generációk számának függvényében  =  -/  + p=0,01 f      33 gen. alatt eltűnnek a + sejtek!

f     (  ) 33 gen. alatt eltűnnek a + sejtek! p=0,01  =  -/  +

Plazmidtartalmú mikrobák tenyésztése és kinetikája Plazmidos sejtek hányadának változása az  függvényében p= f  =  -/  + Stabilis tartomány Tipikus tartomány 1 25 Mi lesz 25 gen. alatt? 0 1,1

Plazmidtartalmú mikrobák tenyésztése és kinetikája KEMOSZTÁT A p-s tag kiesett! Állandósult állapotban  =  -/  + * ** ***

Plazmidtartalmú mikrobák tenyésztése és kinetikája Ha α=1 nincs metabolikus megterhelés (csalás a +sejtek javára) * és** A megfigyelés kezdete Csökken !!! Nő!!! Ha α=1 *,**,*** Szimultán differenciál egyenletek számítógéppel Megoldhatók.