Szűrőelemek a biotechnológiában Takács Enikő Bencsik Dániel

Szűrés Az a művelet, melynek során szilárd halmazállapotú elválasztása történik folyékony vagy légnemű közegtől Cél: Szilárd anyag kinyerése Folyékony közeg tisztítása Levegő tisztítása Alkalmazhatóság Iparban és laboratóriumban Gázok és folyadékok esetén Szakaszos és folyamatos üzemmódban

Szűrési típusok Dead-end Cross-flow A betáplálás merőleges a szűrőfelületre Szűrőlepény Eltömődés Szakaszos Tisztítás Cross-flow A betáplálás párhuzamos a szűrőfelülettel NEM jön létre szűrőlepény Recirkuláció Nagyobb energiaigény recirkuláció betáplálás betáplálás sűrítmény szűrőlepény szűrő szűrő szűrlet szűrlet

Szűrőelemek a biotechnológiában Felhasználás Sterilezés: fermentorok és bioreaktorok betáplálásához Elfolyó/kiáramló anyag tisztítása Termék tisztítása Sejt és sejttörmelék szeparáció Steril végszűrés Kiegészítő folyamatokban

Szűrők osztályozása Abszolút szűrőképesség: Névleges pórusméret: Kiszűrendő részecskék visszatartása alapján Abszolút szűrőképesség: annak a legnagyobb (kemény, gömbalakú) részecskének az átmérője, amely már képes áthaladni a szűrőn adott vizsgálati körülmények között. Tehát megadja a szűrő legnagyobb nyílásának, pórusának átmérőjét. Névleges pórusméret: a gyártó által meghatározott átmérő (μm). A szűrő valahány százalékot visszatart egy adott méretű vagy annál nagyobb részecskéből.

Szűrők hatékonysági mutatói A szűrő hatékonyságát a százalékos visszatartás adja meg Béta-hányados (egy adott szemcseméretnél) befolyó fluidum koncentrációja elfolyó fluidum koncentrációja Titer csökkenés (TR) a béta-hányados egy adott mikroorganizmusra nézve Ezeket a jellemzőket előírt, adott feltételek mellett kell meghatározni, mert a beépítendő szűrőelem kiválasztása ezen paraméterek alapján történik!

Szűrőbetét beépítése/tervezése A beépíteni kívánt betét: teljesítse a kívánt eltávolítási hatásfokot feleljen meg az üzeni körülményeknek (hőm., nyomáskülönbség, áramlási sebesség) legyen kompatibilis a szűrendő fluidummal feleljen meg az alaki és mechanikai feltételeknek, követelményeknek legyen állandó pórusú max. nyomáskülönbség esetén se váljon le belőle elemi szál vagy szemcse Anyaga: PP Pamut Gyanta-impregnált üvegszál Cellulóz Nylon Poliamid Poliszulfon Poli(vinilidén-fluorid) Teflon

Szűrőtípusok: Mélységi szűrők 1. Polipropilén mélységi szűrőbetétek Szerkezet Nem foszló, folytonos polipropilén szálak Gyanta jellegű kötőanyagot NEM tartalmaz Felépítés Belső rész: konstans pórusátmérő megfelelő visszatartás biztosítása Külső rész: állandó hézagtérfogat szálak átmérője kifelé nő pórusátmérő nő Alkalmazás Előszűrőként (szérum, vakcina, ionmentes víz tisztítása) Fermentációnál (folyékony tápoldat, víz, oldószer, habgátló szűrése) Downstream műveletnél (sejt és sejttörmelék eltávolítása; puffer, tisztítószer, fertőtlenítő oldat szűrése)

Szűrőtípusok: Mélységi szűrők 2. Polipropilén redőzött szűrőszövetek Szerkezet Nem foszló, folytonos polipropilén szálak Felépítés Belső rész: konstans pórusátmérő Külső rész: állandó hézagtérfogat pórusátmérő kifelé nő Vékony redőzött lapok hengeres tok PP szilárdító belső mag és külső védőkosár Működési határ 550 kPa nyomáskülönbségig max. 50 °C 410 kPa nyomáskülönbségig max. 80 °C Alkalmazás Előszűrőként (üzemi víz, mosóvíz, tápoldatba szükséges szérum tisztítása) Downstream műveletnél (sejttörmelék eltávolítása; puffer, oldószer szűrése) hegesztés

Szűrőtípusok: Mélységi szűrők 3. Gyantamentes cellulóz redőzött szűrőszövetek Szerkezet Tiszta cellulóz szálakból szőtt szövet Felépítés Nagy felületű hengerben felhajtogatott cellulóz szövet Működési határ 550 kPa nyomáskülönbségig max. 50 °C 410 kPa nyomáskülönbségig max. 80 °C Alkalmazás Előszűrőként (üzemi vízhez, mosóvízhez, RO membránhoz, ionmentes vízhez; fermentor és bioreaktor levegőjéhez)

Szűrőtípusok: Mélységi szűrők 4. Gyantával impregnált üvegszál alapú redőzött szűrőszövetek Szerkezet Gyanta bevonat Felépítés Szűrősapka Hordozó felület PP külső váz/ védőháló Működési határ PP sapka esetén: 550 kPa nyomáskülönbségig max. 50 °C 410 kPa nyomáskülönbségig max. 80 °C Rozsdamentes acél esetén: 520 kPa nyomáskülönbségig max. 135 °C PP rozsdamentes acél

Szűrőtípusok: Mélységi szűrők Redőzött szűrőszövetet tartalmazó szűrőpatron elvi vázlata

Szűrőtípusok: Mélységi szűrők 5. Porózus rozsdamentes acél szűrők Szerkezet Porózus fém hordozó Felépítés Rozsdamentes acél szemcsék összesűrítése Síklap/varratmentes henger Tulajdonságok Nagy kapacitású Hő- és korrózióálló Gázok tisztítása esetén abszolút szűrőteljesítmény: 0,4-11 μm között Kémiailag/mechanikailag jól tisztítható gazdaságosan újrafelhasználható

Szűrőtípusok: Membrán szűrők, szűrőszövet betétek Mikropórusos anyagból készül Abszolút visszatartás folyadék esetén: 0,04-1,2 μm között (tehát megfelel a 0,2-0,45 μm tartományú standard ipari sterilitási kritériumnak mikroorganizmusok szűrésére alkalmas) Szerkezet A membrán nem szövött PÉ/PP rétegek között szilárdító és folyadékelvezető funkció Alkalmazás Egyszeres membránréteg: előszűrőként Dupla membránréteg: steril szűréshez

Szűrőtípusok: Membrán szűrők, szűrőszövet betétek 1. Hidrofil membrán szűrőszövet betétek Anyaga nylon66 hidroxilezett poliamid poli(vinilidén-fluorid) poliszulfon egyéb polimerek Feltételek hidrofil egyenletes nedvesedés adalékanyag bevonat Alkalmazás Előszűrőként Végső steril szűrőként leoldódhat diagnosztikai reagenshez, tiszta vízhez, injekcióhoz készülő vízhez, száraz gázhoz, szerves oldószerhez, pufferhez, biológiai folyadékhoz (pl.: szérum, plazma táptalaj, fehérjeoldat, fermentlé)

Szűrőtípusok: Membrán szűrők, szűrőszövet betétek 2. Kis fehérjekötő kapacitású membrán szűrőszövetek Anyaga hidroxilezett poliamid poli(vinilidén-fluorid) poliszulfon egyéb polimerek Tulajdonságok hidrofil cm2-ként 5 μg fehérjénél kevesebbet köt meg Alkalmazás 1 mg/ml-nél kisebb fehérjetartalmú oldat szűréséhez, amelynél minimális fehérjeveszteséget szeretnénk elérni (szérummentes táptalaj, fehérje alapú gyógyszer, diagnosztikum, híg fehérjetartalmú puffer, hormon)

Szűrőtípusok: Membrán szűrők, szűrőszövet betétek 3. Hidrofób membrán szűrőszövet betétek Felépítés 2 PP támasztóréteg között 2 réteg hidrofób poli(vinilidén-fluorid) vagy poli(tetrafluor-etilén) membrán Feltételek hidrofób 100%-os baktérium- és bakteriofág-visszatartási hatásfok (levegő és gázáramban, nedves és száraz körülmények közt egyaránt) Abszolút szűrőképesség folyadékban: 0,2 μm Abszolút szűrőképesség levegő és egyéb gáz esetén: 0,01 μm Ki kell bírnia többszöri in situ gőzsterilezést mindkét irányba történő átfúvatással és autoklávozással (165 óra, 142 °C) Alkalmazás Fermentorban: bemenő steril levegő előállításához, kimenő gáz szűréséhez Steril levegő és nitrogén előállítása aszeptikus tárolótankhoz, csomagoláshoz, agresszív oldószerhez

Szűrőházak Kiválasztási szempontok Áramlási viszonyok (gyártó által előírt) Nyomáskülönbség Gyártása gépészeti szabvány alapján (ismert max. üzemi hőmérséklet és nyomás) Anyagoknak ki kell bírni a sterilezést és a feldolgozandó fluidummal való érintkezést rozsdamentes acél/szénacél Egészségügyi és fermentációs felhasználás, levegő- és gáztisztítás: CSAK rozsdamentes acél (belső felületek átlagos felületi érdessége 0,51-0,64 μm elektropolírozással) Feltételek A szűrő: ne akadályozza az áramlást ne okozzon veszteséget átengedett elfolyó folyadék által cseréje során ne szennyeződjön a reaktor ne engedje a szűrlet és a szűrendő folyadék keveredését Legyen kondenz elvezetés CSAK hegesztéses csőkötés (NEM csavarmenetes) Tisztítható elemek (lehetőleg helyben)

Szűrőházak Néhány szűrőház és elvi vázlata

Szűrők alkalmazása a fermentációs eljárásokban Alkalmazási terület (ábra szerinti számozással) Szűrőtípus Abszolút szűrőképesség (m) 1 Gőz: tisztításhoz és sterilezéshez 2 Levegő előszűrés 3 Fermentorlevegő steril szűrése 4 Levegő buborékoltatás 5 A távozó gáz előszűrése 6 A távozó gáz sterilizáló szűrése 7 Adalékanyagok, víz és nyersanyag előszűrés 8 Az adagoló tartályba, tároló tartályba, fermentorba sterilizáló szűrése 9 Tartály kilevegőzés Porózus rozsdamentes acél Cellulóz szűrőszövet Hidrofób membrán Polipropilén szűrőbetét Polipropilén mélységi(+ töltött), gyantakötéses üvegszál szűrőbetét Hidrofil, alacsony fehérjekötő képességű vagy + töltött szűrőbetét 1,2 8,0 0,2 3,0 1,0 0,1

Gőz szűrése A gőzt sterilizálásra használjuk Korróziós termékek a csővezetékekből: részecskeszennyezés kerülhet a gőzbe → szűrés → csökkenthető a sterilszűrőre jutó terhelés Porózus rozsdamentes acél szűrőkkel (1,2 µm)

Fermentációs levegő előszűrése Kompresszorok → nagynyomású levegőáram a bioreaktorokba A) Olajkenésű kompresszoroknál: gyantával impregnált üvegszál alapú szűrők, pozitív zeta- potenciállal → koaleszcencia 0,01-0,5 µm-nél nagyobb víz- és olajcseppek leválaszthatóak

Fermentációs levegő előszűrése B) Olajmentes kompresszoroknál: levegőben lévő vízcseppek és szennyeződések eltávolítása Steril szűrőre jutó terhelés csökken, növekszik az élettartama Cellulóz (8 µm), polipropilén (2,5 µm), vagy üvegszál (3 µm) szűrőszövet

Levegő steril szűrése Steril aerob biológiai folyamatok ← bioreaktorba vezetett levegő szűrése Hidrofób hajtogatott membránszűrők által: víztaszítóak → 100%-os baktérium- és fág visszatartás (nedves, száraz körülményeknél is) Abszolút szűrőképesség: 0,2 µm folyadékokra, 0,01 µm levegőre

Levegőelosztás Levegőeloszlatás a bioreaktorban: finom levegőbuborék képzés ← szűrőelemek Csak mechanikusan nem kevert eseteknél Rozsdamentes acél lapszűrők (3 µm abszolút szűrőképesség folyadékra) Finom levegőeloszlás → nyírásra érzékeny emlős sejttenyészetek esetén is alkalmazható

Elmenő levegő/gáz szűrése Mikroorganizmusok ne kerüljenek a környezetbe: elmenő levegőáram által magával ragadott aeroszol cseppekben távozhatnának Aeroszolok: 1-5 µm tartomány → ciklon, ködleválasztó nem megfelelő eltávolításra Előszűrő: polipropilén mélységi szűrő (1,2 µm) → aeroszol részecskéket, organizmusokat tartalmazó cseppek kiszűrése, kihabzás megakadályozása Steril szűrő: hidrofób membránszűrő (0,2 µm)

Folyékony alapanyagok szűrése Bioreaktorba betáplált habzásgátlók, pH állító oldatok, tápanyagok, feltöltővíz szűrése Előszűrés (opcionális): polipropilén mélységi szűrők Steril szűrés: hidrofil membránszűrő (0,2 µm)

Mycoplasma és vírus eltávolítása tápközegekből Szérum (emlős sejttenyészet) és más biológiai adalékok a sejtkultúra mycoplasma és vírus szennyezésének forrásai lehetnek Mycoplasma eltávolítása: hidrofil hajtogatott membránszűrők (0,1 µm) Vírusok eltávoltása: hidrofil membránszűrők (0,04 µm)

Szűrőelemek alkalmazása a downstream műveletekben Downstream műveletek: fermentorból kapott anyagból nagy tisztaságú, biológiailag aktív termék előállítása Fontos a szennyezések eltávolítása: baktériumok és azok részecskéi, vírusok, biológiailag aktív egyéb molekulák

Elsődleges sejt (főtömeg) és sejttörmelék eltávolítás Fermentlevek nagy szárazanyag tartalma, viszkozitása → inkább centrifugálás, vagy keresztáramú mikroszűrés Szűrőelemek is alkalmazhatóak → nagy kapacitású mélységi előszűrők: gyors eltömődés megelőzésére Előnyeik: Könnyű használat Alacsony beruházási költség Könnyebb, gyorsabb tisztítás és sterilezés Minimális folyadék- és termékveszteség

Elsődleges sejt (főtömeg) és sejttörmelék eltávolítás Iparban: gyakran a centrifugálási lépés után alkalmaznak szűrőelemet → tükrösre szűrés Általában polipropilén mélységi szűrők pozitív töltéssel vagy anélkül Emlős sejtek esetén: 1-5 µm Baktériumok esetén: 0,3-1 µm Nagy sejttörmelék koncentrációnál: nagy felületű gyantával impregnált üvegszál/polipropilén redőzött szűrők; 0,7-2,5 µm

Másodlagos (maradék) sejt és sejttörmelék eltávolítás Termék további tisztítása, néha a sterilitásig Koncentrációtól függően: Polipropilén mélységi szűrő (0,5 µm) Gyantával impregnált üvegszálas szűrő (1 µm) Alacsony koncentráció esetén: hidrofil membránszűrő (0,45 vagy 0,2 µm) → sterilre szűrés

Vírusszennyezés lehetőségének csökkentése Víruseltávolítás: hidrofil membránszűrőkkel (0,04 µm) Az ultraszűrés gyakran nem használható víruseltávolításra, mert a fehérjéket is visszatartja

Downstream rendszerek védelme Olcsó szűrők előszűrőként → csökkentik a drága membrán-, ultraszűrő berendezések terhelését → nő az élettartam, csökken a tisztítási gyakoriság Előszűrés: polipropilén mélységi szűrők

A termék végső tisztítása és sterilre szűrés Kinyerési-tisztítási lépések után a terméket gyűjtőtartályokban tárolják → tovább szennyeződhet Termék végső csomagolása, tárolása előtt egy utolsó tisztítás → tisztaság, sterilitás megőrzése Sterilre szűrés: hidrofil membránszűrők (0,2 µm) Ha a fehérjetermék koncentrációja kicsi → kis fehérjekötő képességű a hidrofil membrán

Szűrőelemek használata a kiszolgáló rendszerekben Víz szűrése: készülékek mosása (CIP: cleaning- in-place), injekció minőségű víz (WFI) Vegyszeroldatok szűrése Tartályok, csövek, szivattyúk „kilevegőzése”

Szűrők gőzsterilezése Lehetőségek: In situ gőzsterilezés (leggyakoribb), autoklávban történő sterilezés Irányelv a gyakorlatban: legalább 121 °C-on, 30 percig kell sterilezni Elhelyezés: gőzkondenzátum el tudjon csorogni, minél rövidebb steril csőhossz Sterilező gőz száraz, telített, szennyeződésmentes → rozsdamentes acél előszűrő Felhasználás után steril oldal irányába kell átmosni a szűrőket Ellenirányú nyomás nem alkalmazható → integritás elvesztésével járhat → Gőz lezárása után inert nyomás a szűrőelemre

Szűrőelem integritás tesztek 1. Bakteriális „challenge” teszt Szűrőelemek tényleges baktérium szűrő hatékonyságának vizsgálata Ismert méretű sejteket tartalmazó Pseudomonas diminuta baktérium szuszpenzió (min. 107 db sejt/cm2 szűrőfelület) áthatolás mértéke? Tönkreteszi a szűrőt termelési körülmények közt NEM alkalmazható korreláltatás más, nem destruktív tesztekkel

Szűrőelem integritás tesztek 2. Átáramoltatásos (Forward Flow) teszt Nedvesített szűrő Konstans levegőnyomás diffúziós levegőátáramlás ha ez egy kívánt megengedhető maximális értéknél kisebb, akkor alkalmazható a szűrő  UPSTREAM Adott bemenő nyomás mellett az elmenő oldalon átdiffundált levegő mennyisége? DOWNSTREAM Adott bemenő nyomásállandó értéken tartásához szükséges bemenő gázáram?

Szűrőelem integritás tesztek 3. Nyomástartási (Pressure Hold) teszt Nedvesített szűrő Szelepekkel lezárt szűrőház Gáznyomás csökkenése adott idő alatt, állandó szűrőelem- és gázhőmérséklet mellett? Alkalmazható Sterilezés előtt/után Szűrés előtt/után

Szűrőelem integritás tesztek 4. Buborékpont (Bubble Point) teszt Vizuális teszt Nedvesített szűrő Levegő átnyomás a szűrőn növekvő nyomással elmenő oldali buborékolás vizsgálata Buborékolás: Diffúziós levegőátvitelkor lassú, szemmel követhető Buborékpont után folyamatos

Szűrőelem integritás tesztek 4. Vízelárasztási (Water Intrusion) teszt Nedvesített szűrő Hidrofób membránnál alkohol oldattal termelési körülmények közt nem mindig alkalmazható hidrofób szűrőelemeknél vízelárasztási teszt Szűrőház bemenő oldali vízelárasztása nyomás növelés mellett milyen nyomásnál kezd el folyni az elmenő oldalon a víz?

Szűrőelem integritás tesztek Ezen teszteket automatizáltan használják biotechnológiai vállalatoknál Teszt kiválasztása: célszerű a szállítótól informálódni

Köszönjük a figyelmet!