SZERVES SAVAK 1. Citromsav

Általános tudnivalók Képlete: Összegképlete: C6H8O7 Molekulatömeg: 192 g/mól Tulajdonságai: Fehér, kristályos, kellemesen savanyú ízű anyag Háromértékű gyenge sav, így savasításra illetve pufferek készítésére fel lehet használni Előfordulása: A TCA (vagy Szent-Györgyi-Krebs) ciklus része, ezért szinte a legtöbb szervezetben előfordul Bizonyos citrusféléknek a termésében (lime, citrom) a szárazanyagnak akár a 8%-át is elérheti a citromsav, ennek a kinyerésére is vannak eljárások

Felhasználása Körülbelül 60%-ban az ital- és élelmiszer ipar használja fel pl: gyümölcslevek és gyümölcslé sűrítmények, lekvárok ízesítése, kon-zerválása –a száma E330 A gyógyszeriparban is felhasználják pl: vas-citrátot a vas bevi-telére, a nátrium sóját véralvadás gátlásra, kalcium bevitelre az angolkór megelőzésére, és kozmetikumok tartósítására Pufferelésre használják a háztartási tisztítószerekben Felhasználják a fémiparban felületek tisztitására, passziválásra (salétromsav helyett – ahol ez nem alkalmazható) Mosószerekben is felhasználják a víz lágyítására a foszfátok he-lyett mert nem okoz eutrófizációt, és emiatt a foszfát alapú lágyí-tok bizonyos országokban be vannak tiltva.

Termelés 1929 5 000 t/év 1953 50 000 t/év 1976 200 000 t/év 1980 350 000 t/év 2007 1 600 000 t/év Több milliárd dolláros piac A többi szerves savval ellentétben kizárólag fermentációs úton termelik (vagy citrusfélék terméséből)

Történet 1784 - SCHELE izomból izolálja 1923-ig citrusból termelik 1913 - ZAHORSKY citromsav termelő törzset szabadalmaztat 1917 - CURRIE: felületi eljárás, cukor, pH=2, Hozam: +60 % 1918 - Első CS üzemek Belgium, Pfizer (USA), Sturge (Anglia) 1928 - Felületi üzem Kaznejov, melasz. LEOPOLD: K-ferrocia- nid +20 % 1950 - Perquin, Kluyver Lab., Szűcs (P-limitáció) SZUBMERZ! +80 % 1960 - n-paraffin: Candida (Szardínia)

Bioszintézis A glikolízíssel kezdődik: Vázlatosan: glükóz  fruktóz-6-P  fruktóz-1-6-P  …  PEP   Piruvát  acetil-CoA  citrátkör Fontos a megfelelő oxigén ellátottság, mert a szintézis irreverzibilisen leállhat (a micélium-képződésé nem)

A TCA kör

Citromsav bioszintézis citoszól mitochondium

Citromsav bioszintézis Anyagcsere mérnöki beavatkozás: a továbbalakulás megakadályozása: olyan mutánsok kellenek aminek az akonitáz és izocitrát dehidrogenáz ak-tivitása kicsi. a citrát szintetáz aktivitása legyen nagy a citromsav felhalmozódása miatt nincs oxálacetát kép-ződés, ez az anaplerotikus utakon át történik (mint a lizin-nél): Piruvát + CO2 + ATP  oxál-acetát + Pi + ADP (Mg, Fe és K ionok kellenek a piruvát karboxiláznak) PEP + CO2 + ADP  oxál-acetát + ATP (Mg, K, Mn és ammónium ionok kellenek a PEP karboxiláznak)

Szubsztrátok, törzsek Melaszt, keményítő hidrolízátumot és hulladék szénhidrátot használnak mint szénforrást (szacharóz, glükóz) A melasszal a probléma, hogy ha szennyezett, például a Fe, Mn vagy Zn ionok mennyisége túl magas, akkor negatí-van hat a termelésre – ilyenkor ioncserélő oszlopokon ki-vonják a kationokat. Általában Aspergillus niger vagy wentii törzseket használ-nak (magas hozam, elnyomható az izo-citromsav, és glü-konsav termelés) Szénhidrogénekn is lehet fermentálni magas konverzióval Candida lipolytica törzzsel, de a probléma az alkánok rossz vízoldhatósága és nagyobb arányban keletkezik izocitrom-sav. Másrészt meg kell szabadulni a szénhidrogén nyo-moktól, mert egyesek karcinogének. (+ a kőolaj ára)

Tápoldat C-forrás: lásd fent N-forrás: NH4+ (vagy NO3-). NH4+ jobb: lásd bioszintézis. Az ammónia elfogyasztásával savanyodik a közeg: jó hatású P felesleg: kedvez a citromsav és oxálsav képződésnek Nyomelemek: Fe és Zn limit kell a citromsav képződéshez. Ha kevés: lassú növekedés és cukorfelhasználás  A vas az akonitáz kofaktora! A szaporodáshoz 2000 μg Fe/liter az optimális, a savtermelő szakaszban 50 – 200, Befolyásolja a pelletképződést is. A vastartalom csökkentésére a melaszt ioncserélni kell, vagy K-ferrocianidot adnak. Csak rozsdamentes készülékekben! A vas hatását ellensúlyozza: - MeOH - Cu adagolása - alacsonyabb hőmérséklet Mn > 20 μg/l felett a citromsavképződés csökken

Fermentációs paraméterek Oldott oxigén koncentráció: ha alacsony, csökken a cit-romsav termelés  inten-zív levegőztetés, néha O2 dúsítás! Ha kimarad a levegőztetés: a savtermelés leáll (a sejt-szaporodás újraindul) Kulcskérdés a morfológia  pelletképződés 

Fermentációs paraméterek pH: a melléktermékek képződését – fertőzési kockázatot befolyásolja Optimális pH=1.5 – 2.8 pH < 3 csak citromsav-képződés (az extracelluláris glü-kóz-oxidáz inaktiválódik) pH = 6 felett oxálsav képződés pH = 3-6 oxál- és glükonsav képződés is ha nincs pufferolva a közeg, a pH gyorsan 3 alá megy – de a melasz erősen pufferol  savanyítás kénsavval ilyen savas közegben kicsi a befertőződés veszélye. Hőmérséklet: Optimális = 28 – 33°C Ha <28 °C a citromsav képződési sebesség csökken Ha >33 °C  oxálsav képződés

Felületi tenyésztés Zárt kamrák: mosható, dezinficiálható (HCHO, gőz …) Állványokon tálcák (alumínium, mert rozsdamentes), (4 x 2,5 x 0,15 m) kb: 400-1200 l tápoldat. Tápoldat: hig melasz (cukor: 15-20%) + tápanyagok pH=6–6,5 K-ferrocianid - melasz minőség szerint: próbafermentáció Funkció: Fe, Mn, Zn eltávolítás, Feleslege a növekedést limitálja és a citromsav képződést növeli. C= 10-100mg/l Inokulum: konidium szuszpenzióval (100-150 mg/m2) Fermentáció: steril levegőbefúvás: nedvesség, hőmérséklettar- tás, O2 bevitel, CO2 eltávolítás Jelentős a bepárlódás: 30-40 % Fermentációs idő: 10-15 nap Hozam: 65-75 % Produktivitás: 7-8 kg citromsav/m3*nap. De olcsó.

Micélium (állattakarmány) Felületi tenyésztés fermentlé Melasz tart. sterilizálás Répamelasz Anyag el. Spóra Levegő fermentáció micélium elválasztás Micélium (állattakarmány)

Szubmerz tenyésztés Fermentor: 120-220 m3 keverős reaktor 200-1000 m3 air-lift, merülő-sugaras (pelletképzés)! Tápoldat: melasz tisztítás (ioncsere – k. ferrocianid) kukorica (elfolyósítás - elcukrosítás) Inokulálás: konidium vagy vegetatív(pellet) inokulum: 12 órával rövidebb! Fermentáció: levegőztetés: 0,2-1 vvm (O2 dúsítás)! hőmérséklet: 28-33 oC pH szabályozás: 2-2,6 2-3 nap pelletképződés, 5-8 nap citromsav képződés (függ a cukor koncentrációtól, a használt törzstől) Általában fed batch: 5% cukorral indul. Majd cukor és K‑ferrocianid rátáplálás

Szubmerz tenyésztés Fermentáció: Állandó mikrosz-kópos megfigyelés (pellet) citromsav konc.: 130 g/l melaszon; 200-250 g/l cukorból Konverzió: 87-92 %; Produktivitás: 0,67-0,75 kg citromsav/m3*h; ~16-18 kg citromsav/m3*nap Fruktóz: a szaharózból képződik invertálódással. Kezdetben polimerizálódhat

Szubmerz tenyésztés Anyag el. Nádmelasz Melasz tart. Spóra oltóanyag előállítás sterilizálás fermentáció Levegő micélium elválasztás Micélium (hulladék)

A feldolgozás lépései micélium szűrő segédanyag mésztej + FeCl3 1. MICÉLIUM ELVÁLASZTÁS 2. OXALÁT FERROCIANID ELTÁVOLÍTÁS 3. KALCIUM-CITRÁT KICSAPÁS ÉS ELVÁLASZTÁS 4. CITROMSAV FELSZABADÍTÁS ÉS GIPSZ ELVÁLASZTÁS micélium szűrő segédanyag IZOLÁLÁS mésztej + FeCl3 hulladék mésztej fermentlé ANYALÚG H2SO4 gipsz

A feldolgozás lépései 1. Micélium elválasztás → vákuum dobszűrő 0,2 – 1,0 mm átmérőjű göbök → Newtoni szuszpenzió, nyálkaképzés nehezíti a szűrést, szűrősegédanyag → szalmatörek 2., Oxalát mentesítés → termékminőség miatt, Ca(OH)2 adagolás → Ca-citrát kicsapódás veszélye (csak monosó) Klarifikálás → pl. nyomó szűrő, Funda szűrő, A fenti két lépést kihagyják, ha nem használják a micéliumot 3., Ca-citrát kicsapás → fontos paraméterei: citromsav koncentráció, hőmérséklet 70-90 oC, pH ~7, Ca(OH)2 adagolás üteme, mono-, di-, tricalcium citrát egyensúly → oldható-ság, nagy kristályok képződése előnyös → szenny., pH 7, 18-25%-os CaO,nagymennyiségű hő szabadul fel → hasznosítás, szűrés → vákuum dobszűrőn 4., citromsav felszabadítása 60-70 %-os H2SO4 felesleggel (1-2 g/l) képződő gipszet vákuum dobszűrőn szűrik

citromsav felszabadítás Feldolgozás, izolálás gipsz (hulladék) kicsapás fermentáció cefre citrát elválasztás bepárlás Citragil (takarmány) citromsav felszabadítás gipsz elválasztás citromsav nyersoldat

A feldolgozás lépései-II 1. SZÍNTELENÍTÉS ÉS IONMENTESÍTÉS 2. KONCENTRÁLÁS 3. KRISTÁLYOSÍTÁS KRISTÁLY SZEPARÁLÁS 4. SZÁRÍTÁS 5. APRÍTÁS, OSZTÁLYOZÁS 6. CSOMAGOLÁS aktív szén, gyanta, regeneráló sav jelentős sótartalmú oldat TISZTÍTÁS ANYALÚG MÉRETEN KÍVÜLI

A feldolgozás lépései-II 5. Színanyagok eltávolítása → aktív szenes oszlopon Ionok eltávolítása → kationcserélő, anioncserélő, regenerálás erős savval ill. bázissal 6. Tiszta citromsav oldat koncentrációja: 200-250 g/l → további koncentrálás - Többfokozatú vákuum bepárló , kb. 40 oC 7. Kristályosítás vákuumkristályosítóban 36,5 oC alatt → képződő termék citromsav-monohidrát 40 oC felett → vízmentes termék kristálycentrifuga → az anyalúg visszavezetése a folyamatba 8. Szárítás 36,5 oC alatti hőmérsékleten (kristályvízvesztés)

ioncserés sótalanítás Tisztítás ioncserés sótalanítás bepárlás kristályosítás centrifugálás szárítás aprítás osztályozás CSOMAGOLÁS citromsav nyersoldat

Melléktermékek, szennyvíz 1 tonna citromsavra számítva: Micélium: 135 kg (25 – 30 % fehérje, 15 – 20 % szénhidrát) Takarmány – trágya – papíripar Gipsz: 1,4 t építőipar Szennyvíz: 8 m3, 5 – 6 % szárazanyag; KOI ≈ 50 000 mg/l Feldolgozása: Bepárlás (szárazanyag: 65 – 70 %) takarmány kiegészítő (Citragil) (Az ár nem fedezi a költségeket) Élesztősítés: Torula 14 kg/ m3; 112 kg/8 m3 Biogáz: ANAMAT eljárás. Output: CH4, CO2, víz Aerob és anaerob eljárás kombinációja