Biotechnológia – bevezetés Mikroorganizmusok, állati és növényi sejtek/ szövetek vagy ezek részeinek (pl. enzimek) felhasználása céljából Biokémia Mikrobiológia Mérnöki tudományok Biotechnológia Alkalmazás

A biotechnológia alkalmazási területei Gyógyszeripar (egészségügy, antibiotikumok, vírus ellenes szerek     enzimek, aminosavak, vitaminok, peptidek, szteroidok) Élelmiszeripar (keményítők, cukrok, illat és színanyagok, sör- és alkoholos italok előállítása) Mezőgazdaság (állat- és növényegészségügy, takarmány-kiegészítők, vitaminok, adalékanyagok) Embriómanipuláció (génsebészet) Biometallurgia Biológiai ásványfelhasználás (meddő kőzetek hasznosítása, amelyek hagyományos módon nem dolgozhatók fel) Fermentáció: mikroorganizmusok optimális körülmények melletti tenyésztése és metabolitok (hasznos metabolitok) előállítása Alkalmazása pl.: szövettenyésztés, rögzített sejtek, enzimek alkalmazása gyógyszerek stb. előállítására  Vegyipar: etanol, szerves savak, biopolimerek stb. előállítása

A fermentációs (biotechnológiai) eljárások céljai/lehetőségei Sejttömeg termelés — pékélesztő, SCP Sejtkomponensek előállítása — intracelluláris enzimek, poliszacharidok, nukleinsavak… Metabolit termelés — primer: etanol, tejsav… szekunder: antibiotikumok Egyszerű szubsztrát konverzió — glükózfruktóz penicillin 6-NH2-penicillánsav Multi-szubsztrát konverzió — biológiai szennyvíztisztítás

A termékképző folyamat fajtái Fermentációs folyamat (bioszintézis) Szaporodó sejtek Tápanyagok  Termékek Biotranszformáció / Biokonverzió Sejt, sejtalkotórész A Anyag B Anyag Enzim

A fermentációs technológiák főbb termékcsoportjai (klasszikus) Alkoholok (etanol, butanol, glicerin, alkoholos oldatok – sör…) Szerves savak (Ecetsav, citromsav, glukonsav, tejsav…) Aminosavak (Glu, Lys, Arg, Try, …) Enzimek (Amilázok, katalázok, …) Vitaminok (Bx, b-karotin) Antibiotikumok (penicillinek) Szteroidok (fogamzásgátló intermedierek) Poliszacharidok

A fermentációs technológiák főbb termékcsoportjai (modern) Monoklonális ellenanyagok Immunreagensek Inzulin Humán növekedési hormon Marha somatrotropin Plazminogén aktivátor Interferonok Kalcitonin Hepatitis B-vakcina

Az ipari jelentőségű mikroorganizmusok típusai Baktériumok: méret 0.5-5 µm; gömb, pálca vagy spirális osztódással szaporodnak, egyesek spóraképzők Sugárgombák: (aktinomiceták): fonalas szerkezet (micélium), hosszirányú növekedés, spóraképzők (szaporító képlet) Élesztők: ovális alakú, 5-20 µm, szaporodás főleg sarjadzással, a leánysejtek együtt maradnak 1-10 sejtig. Penészek: 4-20 µm fonalas szerkezet (hifa), szaporodásuknál az ivaros és vegetatív szakaszok váltakoznak, jellegzetes spóratartókat fejlesztenek.

Az ipari jelentőségű mikroorganizmusok típusai A baktériumok gyakori morfológiai típusai Gombák Saccharomyces Schizosaccharomyces ellipsoideus octosporus Aspergillus niger Penicillium glaucum

A mikroorganizmusok fejlődését, növekedését befolyásoló tényezők Tápanyagok Víz (gombák 12%, baktériumok 20%) Makrotápelemek Mikrotápelemek Növekedési faktorok, vitaminok Oxigén Aerob, anaerob… Hőmérséklet Pszichrofil, mezofil és termofil pH

Táplálkozási típusok szénforrás és energiaforrás alapján Fototróf (fényenergia hasznosítás) Fotolitotróf (C-forrás CO2) Fotoorganotróf (C-forrás szerves vegyület) Kemotróf (redoxi reakciók energiájának hasznosítása) Kemolitotróf Kemoorganotróf

Egy termelő fermentációs folyamat megvalósításának lépései 4.A. Keverés (anyagátadás)    2.A. Sterilezés 2. Tápanyagok Si 1. Oltóanyag Termelő törzs 3. Reaktor 6. Matematikai modell 5. Mérés (adatok) Szabályozás, vezérlés ooooo 7. Termék feldolgozási műveletek 4.B. Levegőztetés Anyagátadás

UP STREAM MŰVELETEK A tenyésztéshez / átalakításhoz közvetlenül kapcsolódó műveletek: Tápoldat (reakcióelegy) készítés Sterilezés Tenyésztés optimális körülményeinek biztosítása Anyagátadási és hőátadási műveletek stb.

A FERMENTLÉ FELDOLGOZÁSA (DOWN-STREAM PROCESSING) 1. Szilárd-folyadék elválasztás ( a fermentlé folyadékfázisától különítik el a sejttömeget, és/vagy a táptalaj szilárd szemcséit, esetleg a kikristályosodott terméket.) Jellemző műveletek: szűrés, centrifugálás, membránszűrés (Sejtfeltárás) Csak akkor szükséges, ha a kinyerni kívánt anyag a sejteken belül található (intracelluláris). 2. Izolálás (a legnagyobb mennyiségű szennyezéseket, elsősorban a vizet távolítják el, általában fázisváltással.) Jellemző műveletek: extrakció, adszorpció 3. Tisztítás (a termék és a szennyező anyagok elválasztása) Jellemző műveletek: kicsapás, membránszűrés, kromatográfia 4. Végtisztítás (a terméket a forgalomba hozás - a gyógyszerek esetében igen szigorú - előírásainak megfelelő tisztaságig tisztítják.)

Ipari mikrobiológiai műveletek kivitelezése Oltótenyészet készítése (termelő törzs) Tápanyagok- tápoldat készítése (sterilezés) Bioreaktor Fermentációs műveletek (levegőztetés, keverés…) Adatgyűjtés Matematikai modellezés Termékek további feldolgozása (izolálási, tisztítási műveletek)

Törzsszelekció, törzsjavítás, törzsfenntartás Törzsszelekció: mikroorganizmusok izolálása (törzsgyűjteményből, szennyvízből, talajból…) Mérsékelt termelőképességű törzsek Törzsjavítás, törzsfejlesztés Nagyobb termelőképességű mutánsok (pl. Enzimfehérjében változás bioszintetikus útban blokk) Törzsfenntartás Cél: maximális termelőképesség megőrzése folyamatos átoltás termelőképesség csökken tartósított tenyészetek

Fermentációs folyamat – oltótenyészet útja  

Üzemi fermentorok szerelvényei

Fermentorok Mini enzimfermentor Pilot méretű fermentáció (orvosi kutatás) Enzimfermentor szabályozó egységekkel Mini enzimfermentor Nagyüzemi fermentáció (borászat)

Fermentációs tápoldatok C-forrás + N-forrás + O2 + ásványi sók + speciális tápanyagok (pl. vitamin) Új sejttömeg (ΔX) + termékek + CO2 + H2O Tápanyag igény Tápoldatok (természetes alapú, félszintetikus, szintetikus)

MIKROORGANIZMUSOK TÁPANYAG IGÉNYE TERMELŐKÉPESSÉG KÖRNYEZET GENOM Néhány mikróbaösszetétel

Fermentációs tápoldatok Fermentációs tápoldat mikroorganizmusok testanyagainak felépítésében, és a termékek szintézisében részt vevő elemeket tartalmaznia kell Mikróba táplálkozási és környezeti igényei optimalizálás Gazdasági szempontok Természetes alapú: élesztőkivonat, húskivonat, pepton… Félszintetikus: pl. kukoricakeményítő, szójaliszt +sók… Szintetikus (C-forrás, N-forrás….)

Sterilezés Tápoldatok sterilezése + Besugárzással (UV, X-ray, g) bár ezeknek ipari jelentősége csekély + Kémiai eljárások + Csírák mechanikus eltávolítása + Gőzsterilezés: Vegetatív sejtek és spórák pusztítása Szakaszos sterilezés + Minden berendezést külön ki kell sterilezni: rendkívüli idő- és energiaigény + Sterilezőszer: 1,5-3bar nyomású gőz Folyamatos sterilezés + A szakaszos sterilezés hátrányait kiküszöbölik + Sterilezőszer: szintén gőzbefúvatás + Hátránya lehet: A nagy hőmérséklet különbség miatt sók csapódhatnak ki. A fermentációs levegőáram sterilezése A mikroorganizmusokra a legnagyobb veszélyt a levegővel bekerülő szennyeződések jelentik, ezért ennek sterilitására különösen kell figyelni. + Szűrés, besugárzás, hőkezelés + Régebben mélyszűrők (üveggyapot) + Ma: üvegszálbetétes szűrőpatronok

A mikroorganizmusok növekedésének kinetikája A tenyészet fejlődésének szakaszai: A. Lappangási (lag) szakasz B. Gyorsuló növekedés szakasza C. Exponenciális növekedés szakasza, korlátlan, kiegyensúlyozott növekedés. D. Lassuló, limitált vagy korlátozott szaporodás E. Stacionárius, stagnáló szakasz F. Hanyatló szakasz tg – generációs idő (két egymást követő osztódás között eltelt idő) tg – minimális és állandó generációs idő - C szakasz

A mikroorganizmusok növekedésének kinetikája MI AZ OKA A HANYATLÓ FÁZISNAK? TÁPANYAG LIMITÁCIÓ TOXIKUS METABOLIT TERMÉK(EK) 3. HELYHIÁNY

A mikroorganizmusok növekedésének kinetikája x0 -a kiindulási mikrobakoncentráció n - a generációk száma tg - a generációs idő (két sejtosztódás között statisztikai átlagban eltelt idő) A generációs idő függ a mikróba fajtól, a tenyésztési körülményektől (tápanyag, hőmérséklet, pH, stb.), sőt még egy adott tenyésztés folyamán is változik.

A mikroorganizmusok növekedésének kinetikája A generációk száma kifejezhető A generációs idő kifejezhető

A mikroorganizmusok növekedésének kinetikája A növekedési sebesség arányos a jelenlévő mikróba-mennyiséggel µ - Az exponenciális szakasz jellemző állandója (spec. növekedési sebesség) µ értéke csak akkor állandó, ha minden tápanyag elegendő koncentrációban van jelen

A mikroorganizmusok növekedésének kinetikája A µx és a szubsztrátkoncentráció kapcsolata (Monod modell) S – nélkülözhetetlen tápanyagkomponens Ha S kicsi : µ arányos S-el Ha S nagy telítettségi érték Ks- telítési állandó, megegyezik azzal a S-koncentrációval, ahol µ = µmax 2 Ks – baktériumok glükóz 3-7 mg/l µmax 2 Ks

A mikroorganizmusok növekedésének kinetikája µx - Specifikus növekedési sebesség µs - Specifikus szubsztrát-felhasználási sebesség µp - Specifikus termékképződési sebesség Y – hozamkonstans (a keletkező baktériumtömeg/a felhasznált tápanyag) A növekedés és a tápanyag-felhasználás között egyszerű összefüggés

Termékképződési kinetika A termékképződési sebesség és a mikróba-koncentráció ill. a mikróba-növekedési sebesség közti kapcsolat ..\Képek\img002.jpg ..\Képek\img002.jpg

Termékképződési kinetika µp - Specifikus termékképződési sebesség Különböző fermentációs típusok a µx, µs, µp alapján µx µp I. típus II. típus µs I. Termékképződés párhuzamos a növekedéssel (alkoholos erjesztés, szorbózfermentáció…primer anyagcsere termék) II. Termékképződés későn kezdődik – növekedéshez nem kapcsolódó A legtöbb antibiotikum fermentáció – szekunder anyagcseretermék

Fermentáció típusok Batch-fermentáció (szakaszos fermentáció): ez a fermentáció típus képezi az összes ma alkalmazott technika alapját, így a mennyiségi összefüggéseket ez alapján mutatjuk be A paraméterek többségére nézve zárt rendszer Feed-batch (rátáplálásos) fermentáció: a paraméterekre nézve „félig-nyitott” rendszer Kezdetben nem az összes mikroorganizmust tápláljuk be, hanem szakaszosan rátáplálunk  A paraméterek követik a tápanyagtartalmat Folyamatos fermentáció: Folyamatos tápoldat bevezetés, és termékelvétel A paraméterekre nézve nyílt rendszer Megvalósítása: kemosztátban, turbidosztátban, Plug-flow reaktorban

Folyamatos fermentáció előnyei Produktivitása 510- szer nagyobb, mint a szakaszos tenyésztésé Automatizálási lehetőség nagy, az üzem egésze folytonossá tehető Egyenletes terméket biztosít

Folyamatos fermentációs rendszerek Homogén rendszer A sejt és a szubsztrát-koncentráció teljesen egyöntetű Állandósult állapotú folytonos működés esetén az összes mikróba azonos környezeti feltételek között növekszik- azonos fiziológiai állapotban vannak a rendszeren belül Heterogén rendszer A sejtek és a szubsztrátok koncentráció-gradienst mutatnak A mikróbák különböző fiziológiai állapotban vannak Zárt rendszerek A mikroorganizmusok mindig a rendszeren belül maradnak (szemipermeábilis hártya, állandó visszavezetés…) Nyílt rendszerek A sejtek a kiömlő folyadékkal folytonosan távoznak

Nyílt folytonos rendszerek osztályozása Homogén rendszerek Egyfokozatú Kevert tank Kevert tank visszatáplálással Többfokozatú Egyszerű lánc Többszöri szubsztrát adagolás Heterogén rendszerek Egyfázisú csőreaktor visszatáplálással Többfázisú torony folyadék-folyadék folyadék-gáz

Zárt folytonos rendszerek osztályozása Homogén kevert tank visszatáplálással Heterogén Egyfázisú Csőreaktor visszatáplálással Osztott tank visszatáplálással Kétfázisú Hártyatenyészet Töltött torony

Biotechnológiai termékek Felhasználás Termelő mikróba (forrás) Gyümölcssavak pl. citromsav, almasav Italok, dzsemek, szörpök Aspergillus niger, Candida lipolytica Gyümölcssavak pl. borostyánkősav Ízesítő, K-, Ca-, Mg-sók mint NaCl helyettesítők Rhizopus, Mucor, Fusarium Vitaminok (kobolamin, B12) Élelm. kiegészítés Propionibacterium shermanii Enzimek (proteázok) Tésztagyárt., italgyárt., sajtgyárt., húskészítmény Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Aspergillus orizae Gélesítő anyagok Fagylalt, pudingok, habok Acetobacter vinelandii ánizsaldehid illatanyag Trametes sauvolens herbicidin herbicid Streptomyces saganonensis indigó pigment Escherichia coli CefalosporinC (polipeptid) antibiotikum Cephalosporium acremonium Vankomicin (glikopeptid) Streptomyces orientalis

IRODALOM, JEGYZET Nyeste Lajos: Biomérnöki műveletek és alapfolyamatok, Tankönyvkiadó, Budapest, 1990, J 6-816 Sevella Béla: Biomérnöki műveletek és alapfolyamatok, Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem, Műegyetemi Kiadó, Budapest, 2001 Szabó István Mihály: A bioszféra mikrobiológiája, Akadémiai Kiadó, Budapest, 1992