Élelmiszerallergének analitikája Készítette: Pipoly Erika Szabó Orsolya Erzsébet Konzulens: Bugyi Zsuzsanna Korszerű élelmiszervizsgálati módszerek, 2009. 11. 17.

Miről is lesz szó? általános bevezető élelmiszerallergia vizsgálati módszerek Immunanalitikai eljárások: Western blot, RIA, RIE, ELISA, gyors módszerek DNS alapú technika: PCR bioszenzor (pl. SPR) összefoglalás

Elméleti bevezető

Allergia Immunrendszer kóros működése ártalmatlan idegen anyagra kórosan túlzó reakció Autoimmunitás: immunrendszer megtámadja a szervezet saját szöveteit.

Szövetkárosító immunreakciók fajtái: azonnali típusú allergiás reakció (anaphylaxia) gátló/serkentő antitest okozta reakciók immunkomplexek által létrehozott szövetkárosítás késői típusú túlérzékenységi reakció

Az allergiás betegség kialakulását befolyásoló tényezők Környezeti ártalmak A szervezet aktuális állapota Allergének Pszichoszociális tényezők Veleszületett hajlam

A tüneteket kiváltó tényezők : fizikai hatások: hőmérséklet, páratartalom, napfény, nyomás és a fizikai terhelés, vakarás kémiai allergének: fémek, kozmetikumok, tisztítószerek, gyógyszerek, és élelmiszer adalékanyagok biológiai allergének: élelmiszer alkotórészek, pollenek, atkák, állati szőr(tollazat), penészgombák spórái

Élelmiszerallergia csecsemő-,kisgyermekkor– éretlen immunrendszer IgE antitest az allergénhez kapcsolódva váltja ki az allergiás reakciót(ételre irányuló allergiás válaszért felelős). Étkezés után jelentkezik! bármelyik élelmiszer okozhatja (allergének küszöbértéke)

Élelmiszerallergia és a fehérjeszerkezet immunogenitás keresztreaktivitás allergia szempontjából fontos: aminosavszekvencia, fehérjeláncok térbeli elhelyezkedése, a felületi szerkezet epitóp szerkezet

Keresztreakciók Gyümölcsök, zöldségeknyír-, éger-,szilfa, mogyoró (ritkán fűfélék, fekete üröm) Fűszerek fekete üröm, fűfélék Pollent tartalmazó ital! pl. kamilla tea, méz Egzotikus gyümölcsök! pl. nyaraláskor Főzés után enyhébbek az élelmiszer-pollen keresztreakciók.

A jelölés jogi szabályozásának célja a fogyasztó védelme az ember számára a lehető legmagasabb szintű életminőség megteremtése az élelmiszer biztonsága a versenytisztaság az áruk szabad áramlása

Jelölni kell: Tej és tejtermékek Glutént tartalmazó gabonafélék-, Rákfélék-, Tojás-, Halak-, Földimogyoró-, Szója és a belőle készült termékek

Jelölni kell: Diófélék-, Zeller-, Mustár -, Szezámmag-, Csillagfürt-, Puhatestűek és a belőlük készült termékek Kén-dioxid és szulfitok (10 mg/kg, 10 mg/l felett)

A listán nem szereplő anyagok Aszpartám Mono-nátrium-glutamát Benzoesav és származékai Azoszínezékek csoportjába tartozó élelmiszerszínezékek Antioxidánsok (E320,E321,E-311) Sűrítő anyagok (E413) Kókuszdió Kivi Fenyőmag Rizs (főleg Kínában)

Ételallergia Étel-intolerancia komponens irritáló v emészthetetlen pl. laktóz-intolerancia tünetek dózis-függőek immunrendszer kóros válaszreakciója - azonnali tünetek

Vizsgálati módszerek

Összefoglalás Immunanalitika (Western blot, RIA, ELISA, ELISA-PCR) Gyorsmódszerek (LFD, kit, dipsticks) DNS elválasztás PCR-rel Kromatográfiás módszerek (ioncserélő-, méretkizárásos-,adszorpciós kromatogr., RP-HPLC, LC-MS) Egyéb: Bioszenzorok pl. felületi plazmon rezonancia

Immunanalitika

1. Western blot

Western blot molekuláris biológiai módszer biomolekulák komplexében lévő fehérje kimutatására Lépései: gélelektroforézis blottolás (transzfer) blokkolás megjelölés detektálás

Gélelektroforézis ált. SDS-PAGE, a mintában található fehérjék elválasztása molekulaméretük alapján 2D elektroforézis: izoelektromos pont molekulaméret

Blottolás (transzfer) az elválasztott fehérjék átvitele a gélről nitrocellulóz vagy polivinilidén membránra membránon nem specifikus fehérje kötő részek hidrofób kölcsönhatás + elektromos hatások

Blokkolás nem specifikus kölcsönhatások megakadályozása a membrán és az antitest fehérjék között kivitelezés: a membránt szérumalbumin, nem zsíros, száraz tejpor, ill. detergensek oldatába helyezik

Megjelölés 2 lépés primer antitest: a keresett fehérjét felismeri, membránon inkubálják másodlagos antitest: a nem kötődött primer antitestek lemosása után, elsődleges antitesthez köt, inkubáljuk általában enzimmel jelölt (pl. peroxidáz)

Detektálás A nem kötődött antitestek lemosása után. Kolorimetrikus Kemilumineszcencia Radioaktív Fluoreszcens

2. Radioimmunoassay (RIA)

RIA immunoassay: a keresett fehérje (= antigén) – specifikus antitest komplex antitest rögzített, pl. PVC lemezre antigén egy eltérő specifikus helyéhez második antitest köt (radioaktívan v enzimesen jelölt) ELISA, Western blot, RIA, stb.

Az antigén radioaktívan megjelölt formája leszorítja a nem jelölt antigént az ellenanyaggal képzett komplexumából, a jelölés helycseréje kvantitatívan mérhető. Kompetitív gátlás.

RIA kalibráció

3. Rocket immunoelektroforézis

Immunoelektroforézis: gélközegben történő elektroforézis és immunodiffúzió kombinálása Rocket immunoelektroforézis: Az antigén az antiszérumot tartalmazó gélközegben elektromos erőtér hatására diffundál. Két reagens találkozásakor a precipitációs ív egy rakéta körvonalaihoz hasonló. Az antigén koncentráció a terület nagyságával arányos.

4. ELISA technikák

ELISA módszerek (Enzym-linked-immuno-sorbent-assay)

Röviden a módszerekről kvalitatív elemző eljárás (kvantitatív is lehet) Spec. antitestet/antigént kötünk a mikrotiter-lemezenmosás enzimjelölt szekunder antitest/antigén hozzáadása +szubsztrát színreakció (Torma-peroxidáz, alkalikus foszfatáz)

Kompetitív ELISA Példa…???

Kalibráció

Sandwich ELISA Példa…??

Kalibráció

ELISA felhasználási példák Allergénspecifikus IgE antitestek mérése vérben Sandwich: mogyoró, mandula, dió, tojás, gliadin Kompetitív: pl. tejallergének Sajtok, halak, rizspuding, majonéz, spagetti, kenyerek…

ELISA termékek Piaci áttekintés

Mandula, tojás, tejallergének, gliadin, mogyoró, szója 3 féle kit-csomag: Alert (5 ppm, 30 perc, S-ELISA, 20 minta/kit) Veratox (2,5-25 ppm, 30 perc, S-ELISA, 38 minta) Lateral flow kits

mandula, β-lactoglobulin, kazein, tojás, gliadin, szezámmag, mustármag, földimogyoró, szója, csillagfürt Vizsgálati idő ált. 30-45 perc Standard sor: Kit Controls 0, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0 ppm

Néhány példa: csillagfürt: ELISA, RT-PCR kazein: ELISA gliadin: ELISA, RT-PCR, lateral flow test földimogyoró: ELISA, RT-PCR, lateral flow test mandula: ELISA, RT-PCR Tojás, szója, zeller, dió, szezámmag, mustármag, hal, β-lactoglobulin, hisztamin,puhatestűek

mandula, csillaghal, glutén, földi mogyoró, kazein, mogyoró, tojás, szója Biokits Rapid 3-D TM ELISA kitek DNS extrakciós kitek

Tepnel biokitek előnyei Egyszerű, megbízható Gyors Egyszerű használat RAPID 3-D technológia Élelm. mátrix széles skálájára alkalmazhatóak Alacsony szintű allergén kimutatás Azonnali döntéshozáshoz Cseppent és tesztel Innovatív Rugalmas

DNS kimutatás

DNS minták elválasztása: PCR dsDNS, hőtűrő enzimek denaturáció, spec. primerek betapadása, lánchosszabbítás

Publikált PCR módszerek

Mire kell figyelni? mátrixprimerek keresztreakciói! nagyon érzékeny assay kell a multikópiás gének esetén, pl. búza, árpa, rozs nem kell az allergént kódoló gént kimutatni, elég egy allergénre spec. tulajdonság kontamináció elkerülése precíz primer, probe tervezés

Alkalmazások mogyoró, földimogyoró nyomok 10 mg/kg kimutatási határ húshamisítás szójabab lisztérzékenység gluténmentes ételek: búza, árpa, rozskompetitív PCR

PCR detektálása ELISA agaróz gélelfo helyett Számos metódus pl. földimogyoró:  biotinilált PCR termék felvitele a streptavidinnel bevont mikrotiter lemezre

Detektálás menete felülethez kötött denaturált PCR termék + enzimjelölt antitesthez kapcsolt, termékre specifikus probe + kromogén szubsztrát mikroplate-reader

ELISA detektálás előny-hátrány Csak kvalitatív elemzésre jó! Agaróz gélelfohoz képest jóval több minta detektálható Nem kell mérgező vegyszer Nagy a kontamináció veszélye az utómunkák során.

Gyorsmódszerek

Gyorsmódszerek fontossága Előnyök: Gyors eredmény Olcsó Nagy mintaszám vizsgálható Hátrányok: Pontatlanság Precizitás nem megfelelő Kinek mi a fontosabb??

Lateral flow device Az ELISA-val ellentétben az 1 lépéses tesztcsíkon a reakciók szimultán játszódnak le, rendkívül gyorsan. Földimogyoró kimutatás:0,01%!! nyúl anti-conarachin IgG biotinilált nyúl anti-conarachin IgG avidin-torma-peroxidáz kombinációval.

LFD (lateral flow device)

LFD (lateral flow device) Felépítése mintaszűrő (papírszerű, szűr, puffereli a mintát) konjugátum pad (üvegfonálszerű, arany-, latex-, szénkonjugált oldatokban A konjugátum mérete 5-200 nmnöveli az érzékenységét) membrán (nylon, nitrocellulóz) adszorpciós pad (megköti a folyadékota minta továbbfolyik, át a membránon) tesztcsík, és kontroll csík (precízen, membránra rögzített antitest rétegek)

Mintafuttatás a minta átfut a mintaszűrőn és a konjugátum padon Konjugátum: a jelölt, analitra specifikus antitest (Au, latex, szén) Analit-konjugátum komplexát a membránon a teszt zónába a teszt zóna: az immobilizált azonos epitópú antitestet megköti a komplexeket a kontroll zóna: a membrán végén (anti-konjugátum antitestek) Szemikvantitatív CCD kamerákkal

A gyorsteszt felépítése

Assay fajták

Egy példa Biomedal cég kompetitív ELISA tesztcsíkja

Bioszenzorok

Bioszenzorok

SPR (Surface Plasmon Resonance) 2 kulcselem: szenzor vizsgálandó mintát áramoltató mikroberendezés szenzor: üvegfelületre felvitt vékony fémlemez (ált. arany), felületén az adott allergént megkötő ágens felületi plazmonok: fém – dielektrikum határfelületen egy speciális fénysugárral hullámszerű mozgásra kényszerített elektronok

Rezonancia feltétele a gerjesztő fény impulzusának felülettel párhuzamos komponense meg kell egyezzen az azonos energiájú felületi plazmon impulzusával a gerjesztés a fény egy adott beesési szögénél történik meg és ilyenkor a fém felületről visszavert fény intenzitásában egy minimum észlelhető (abszorpció!).

Detektálás a rezonanciának megfelelő beesési szög értéke érzékenyen függ a másik közeg (prizma) törésmutatójától a bekötődés megváltoztatja a felülettel érintkező réteg törésmutatóját rezonancia szög eltolódás érzékeny detektálás analitikai és kinetikai információ: rezonancia szög időbeli változása

immobilizálás kötődés, immunkomplex regeneráció

Alkalmazások szója, borsó és oldható búzafehérjék kimutatási határ: 20-50 ng/ml mogyoró fehérje kimutatási határ: 0,7 µg/ml sajt, tej kazeintartalma kimutatási határ: 85 ng/ml A felhasznált antitest pl. nyúlban termeltetett IgG.

Előnyök Hátrányok gyors detektálás nem igényel jelölést esetleges nem-specifikus kötődések problémákat okozhatnak

OWLS Optikai hullámvezető affinitás szenzor immunspecifikus molekuláris rétegek érzékelése antigén-antitest --- törésmutató változása --- beesési szög változása --- rezonancia

QCM Kvarckristály affinitás bioszenzor bekötődés --- tömegváltozás --- frekvenciaváltozás

Ideális bioszenzor tulajdonságok érzékenység szelektivitás egyszerű kalibráció standardak segítségével lineáris válasz széles konc.tartományban háttérzaj-korrekció beépítés hiszterézismentes dinamikus válasz biokompatibilitás önregenerálódó képesség-monitorozás

Befejezés

Egy kis kromatográfia… Másik fontos terület, erről bővebben majd Zsuzsi… ioncserélő-, méretkizárásos-,adszorpciós kromatográfia, RP-HPLC, stb. Kapcsolt technikák a jövő! Pl. LC-MS, LC-MS/MS

Egyes allergének vizsgálatára elterjedt eljárások diófélék és magvak western blot, ELISA, PCR tej és tejtermékek western blot, RIE, ELISA tojás western blot, ELISA, PCR, SPR szója, hal, puhatestűek ELISA, PCR, SPR glutén western blot, ELISA, PCR, MS (Maldi-TOF)

A jövőről… Az élelmiszerallergia a népesség ~ 2-3%-át sújtja, de ez az érték folyamatos növekedést mutat. A felnőtteknek 1-2%-a, a gyermekeknek kb. 5-8%-a érzékeny valamilyen élelmiszerre. Az legelterjedtebb módszerek:Western blot, ELISA Fejlődés alatt áll:SPR, kromatográfiás kapcsolt technikák. A cél minél érzékenyebb és gyorsabb módszerek kifejlesztése.

Köszönjük a figyelmet!