Kiroptikai spektroszkópia Összeállította: Pál Krisztina

Bevezető A kiroptikai spektroszkópiák jelentősége abban áll, hogy segítségükkel különbséget tehetünk enantiomerek között, vagy diasztereomerek közt. Polarimetria (optikai forgatás adott hullámhosszon), ORD /optikai rotációs diszperzió/ (optikai forgatás a hullámhossz függvényében) CD /cikuláris dikroizmus/ (jobbra és balra cirkulárisan polarizált fény abszorpciója közti különbséget méri a hullámhossz függvényében) Mindegyik technika az (optikailag aktív) anyag és a polarizált fény közti kölcsönhatás mérésén alapszik.

Optikailag aktív, királis anyag Az olyan anyagokat, amelyek a poláros fény rezgési síkját elforgatják, optikailag aktív anyagoknak nevezzük. (A jelenséget kezdetben csak a kristályos anyagok szerkezetének aszimmetriájával hozták összefüggésbe). Arago, kvarckristály (1811) Biot, borkősav vizes oldat (1838) Pasteur, aszimmetria – optikai aktivitás (1848-53) Kekulé (1856-1863), Le Bel és van't Hoff (1874); aszimmetrikus, tetraéderes C-atom Királis: tükörképével nem fedésbe hozható. Az egymással fedésbe nem hozható tükörképi szerkezetek olyan viszonyban vannak egymással, mint a jobb és bal kéz (a kéz görög nevéből - kheir - származik az ilyen szerkezetek királis elnevezése). Optikai aktivitás = forgatóképesség; királis molekulák nem racém halmaza optikailag aktív

Enantiomerek (1) Királis molekulák egymáshoz való viszonya Egy enantiomer az egyike annak a két sztereoizomernek, amelyek egymásnak fedésbe nem hozható tükörképei (mint a jobb és bal kezünk; „ugyanazok”, de mégis ellentétei egymásnak). Szimmetrikus környezetben: azonos fizikai és kémiai tulajdonságok Aszimmetrikus környezetben: különböző tulajdonságok.

Enantiomerek (2) Azonos olvadás- és forráspont, törésmutató, oldhatóság, UV-látható, IR- és NMR spektrum. A különböző viselkedés királis ágenssel való kölcsönhatás esetén érvényesül: Királis oldószerekben oldhatóságuk különbözik Királis vegyületekkel különféleképp reagálnak (pl. diasztereomer képzés, rezolválás alapja) „Királis” fénnyel különféleképp hatnak kölcsön (Diasztereomerek: részleges tükörképei egymásnak; 1 vagy több aszimmetriacentrum abszolút konfigurációja eltér. Epimerek: csak egy aszimmetriacentrum abszolút konfigurációja más)

Kiralitás fajtái Centrális kiralitás Vonal kiralitás Anza kiralitás   Centrális kiralitás Vonal kiralitás Anza kiralitás Helikális kiralitás

A fény polarizációja Nem polarizált fény Síkban polarizált fény Az elektromágneses sugárzás (fény) egy haladó hullám, amely oszcilláló elektromos- és mágneses térből áll, melyek kölcsönösen merőlegesek egymásra. Általában az elektromos tér oszcillációja NEM egy fix (y,x) síkon történik. Ilyenkor a sugárzás NEM polarizált. y z x

Síkban polarizált fény előállítása A polarizációs szűrő a polarizálatlan fényt síkban (lineárisan) polarizált fénnyé alakítja. Erre jó példa a Polaroid szűrő, mely hosszúkás molekulák párhuzamosan rendezett szálaiból áll. Csak a megfelelő irányban polarizált fénykomponens jut át a szűrőn (az erre merőleges komponens tökéletesen abszorbeálódik).   A vertikálisan polarizált komponens átjut. Polarizálatlan fény A horizontálisan polarizált komponens abszorbeálódik (nem jut át a szűrőn).

A lineárisan polarizált fény két cirkuláris komponense

Optikai forgatás A királis minta törésmutatója más a síkban polarizált fény két cirkulárisan polarizált komponensére (jobbra és balra cirkulárisan polarizált fény) nézve. nbal≠njobb Ebből következően a két cirkuláris komponens sebessége más és más, amint királis mintán haladnak át. n=c/v Eredmény: a síkban polarizált fény polarizációs síkja elfordul ( szöggel).

Optikai forgatás (2)

Polarimetria: Az optikai forgatás adott hullámhosszon /589nm (Na D-vonal)/

Optikai forgatás Általában specifikus forgatásként van megadva [], melyet adott hőmérsékleten (T) és hullámhosszon (, ált. 589 nm) mérnek (a minta adott koncentrációjú, adott oldószerrel készült oldatát alkalmazva). Megadása: []D25 = +65° (c=1.0, EtOH) +, óramutató járásával megegyező irány – , óramutató járásával ellentétes Tisztaság meghatározás: Mért specifikus forgatás*100 specifikus forgatás (Pl.: (+6,76°/+13,52°)*100=50%)

Optikai rotációs diszperzió (ORD) Az optikai forgatást mérjük a hullámhossz függvényében. (diszperzió = a hullámhossz függvényében) Detektor: fotoelektron sokszorozó Polikromatikus fényforrás

ORD spektrum A csúcs és a vályú közti metszéspont hullámhossza jól egyezik az abszorpciós max –al.. Egyenletes lefutású görbe (ún. plain curve) - ha a királis molekulában nincsen kromofór (nincs elnyelés). Kromofórt tartalmazó királis minta esetén ún. Cotton effektus (anomália) rakódik a plain curve-re, ott ahol a minta elnyel.

Cirkuláris dikroizmus

Cirkuláris dikroizmus (2) A síkban polarizált fény két cirkuláris komponense (jobbra és balra cirkulárisan polarizált fény) különböző mértékben nyelődik el (abszorbeálódik) királis mintán áthaladva. Összegük: Lineárisan polarizált fény Elliptikusan polarizált fény

CD spektrum Abal A CD spektrumban A-t, -t (egyezményesen bal-jobb) tüntetik fel a hullámhossz függvényében. (néha az ellipticitást (), a moláris ellipticitást []) AbalAjobb A /c·l (A=Abal-Ajobb) = bal-jobb Ajobb A l=190-800nm, e- gerjesztés

Enantiomerek CD spektruma jobb,(R)= bal,(S),  bal,(R)= jobb,(S)  bal, (R)- jobb,(R) = (R) =  jobb, (S)- bal,(S) =  (S) bal, (S)- jobb,(S)=  (S)=  jobb, (R)- bal,(R)=  (R) TÜKÖRKÉPI VISZONY

CD mérés (spektropolariméter) LS (light source) M (mirror), S (slit), P (prism), SH (shutter) Minta (királis) Detektor: Fotoelektron sokszorozó CDM (CD modulátor, fotoelasztikus modulátor): Felváltva állít elő jobbra és balra cirkulárisan polarizált fényt L (lens), F (filter)

UV, ORD, CD összefüggése Ahol az optikailag aktív anyag elnyel: CD jel jelentkezik, míg az ORD spektrumban Cotton effektus. Ahol az anyag nem nyel el: nincs CD jel, ORD-ben plain curve.

A CD spektroszkópia alkalmazásai Enantiomertisztaság meghatározás Abszolút konfiguráció meghatározás Indukált CD: akirális molekuláknak – királis molekulákhoz kötődve – CD jele indukálódik (komplexképződés tanulmányozása). Fehérjék tanulmányozása: másodlagos szerkezet, konformációs változások

Enantiomertisztaság (ee%) meghatározás Ee(%): enantiomeric excess, (enantiomer túlsúly v. enantiomer tisztaság). A racém részen felüli túlsúly.

Enantiomertisztaság meghatározás CD (koncentráció független) Anizotrópia-faktor (g-faktor): A CD spektrum intenzitása/az abszorpciós spektrum intenzitása. Enantiomerekre egyenlő nagyságú, ellentétes előjelű.

Az enantimerek megkülönböztetése, enantiomertisztaság [Miért fontos?] Ma a gyógyszerek 40%-a királis hatóanyagú, sokat ebből racémként hoznak forgalomba. Az enantiomerek farmakokinetikája eltérő, rendszerint különböző receptorokon hatnak. Csak az egyik fejti ki a kívánt klinikai hatást, a másik vagy egyáltalán nem hat, vagy a nemkívánt hatásokért felelős

Racémként hozták forgalomba Contergan-botrány (hatóanyag:thalidomide) Racémként hozták forgalomba A tájékoztató szerint jól használható köhögés, pánikbetegség, migrén ellen, pszichés traumák esetén nyugtatószerként. Nem terheli a máj anyagcseréjét, és a hányingert is csillapítja. Célcsoport: állapotos nők. Feltűnően sok gyermek született elhalt végtagokkal, szellemileg, testileg visszamaradottan.

(R)-izomer (S)-izomer teratogén hatású hatékony szedatívum

Gyógyszerek enantiomerjeinek hatása Salbutamol – asztmások gyógyszere: (R): bronchodilatáció, (S): szívdobogásérzés, vérnyomásemelkedés, tremor. Ibuprofen: (R): hatástalan, (S): lázcsillapító. Penicillamin: (R): toxikus, (S): krónikus artritis (izületi gyulladás) ellen – fájdalomcsillapító, tünetenyhítő.

Az abszolút konfiguráció meghatározás módszerei (1): CD spektrumok összehasonlítása: Kérdéses vegyülethasonló, ismert térszerkezetű vegyület. (2): Tapasztalati szabály: Molekulaszerkezet és a CD sáv előjele közt teremt kapcsolatot. (pl. oktáns szabály) (3): A CD spektrum kvantumkémiai számítása és ennek összevetése a mért spektrummal.

Példa (1) (-)-2a, (2R, 3S) abszolút konfiguráció Azonos sávelőjelek, azonos abszolút konfiguráció   (-)-2a, (2R, 3S) abszolút konfiguráció Ismeretlen abszolút konfiguráció

Oktáns szabály (ketonokra) (2) Amely térrészbe esik az atomok többsége, olyan előjelű lesz a CD sáv. Adott molekula-geometriához meghatározható a karbonil-csoport 300 nm körül észlelhető n→π* elektronátmenetéhez tartozó CD jel előjele. A molekula 3D modelljét úgy kell elhelyezni a koordináta rendszerben, hogy a karbonil csoport felezőpontja a 3 tengely metszéspontjával egybeessen.

Oktáns-szabály alkalmazása (2) (+) Az atomok túlnyomó része (-) térrészbe esik, így ehhez a térszerkezethez negatív karbonil sáv tartozik. (Tengelyre eső atomok hozzájárulása 0). (-) (+) (-) Oktáns projekciós diagram

Oktáns-szabály alkalmazása (2) (+) (-) 11b 2 stabil konformációban létezik, az egyikre negatív a másikra gyenge pozitív karbonil jelet jósol. Összegük: gyenge negatív jel (+)

Oktáns-szabály alkalmazása (2) Pozitív Cotton effektus = Pozitív CD jel Negatív Cotton effektus = Negatív CD jel ORD spektrum (specifikus forgatás a hullámhossz függvényében)

Indukált CD Királis gazdamolekula vagy kötőhely (ciklodextrin, fehérje/enzim kötőhely, DNS) Akirális, kromofór vendégmolekula (színezékmolekula, hatóanyagmolekula). A bekötődő akirális kromofórt a királis környezet vagy szerkezetileg torzítja (királissá teszi) vagy az e-átmeneteit perturbálja  az akirális molekulának a királishoz kötődve CD-jele indukálódik.

Indukált CD cisz-parinársav (kromofór, akirális vendégmolekula) -laktoglobulin (királis host, látható tartományban nincs elnyelése) A cisz-parinársav (akirális, kromofór), a β-laktoglobulinhoz (királis) kötődik. A látható tartományban (cisz-parinársav elnyelési tartományában) CD jel indukálódik

Indukált CD 2 db akirális festékmolekula kötődik a fehérjéhez (anomális CD jel: ún. exciton-azt jelzi, hogy 2 festékmolekula kötödik egy fehérjekötőhelyen). Egyre több festékmolekulát hozzáadagolva, egyre nagyobb az indukált CD jel (egyre több festékmolekula kötődik a fehérjén). A CD jel az akirális festékmolekula elnyelési tartományában jelentkezik.

Fehérjék CD spektroszkópiai vizsgálata Környezeti változások (pH, hőmérséklet stb.) → konformációs változás CD spektrum alakja érzékenyen tükrözi a fehérje konformáció változásait. A CD spektroszkópia jól használható (denaturációs vizsgálatok, fehérjekötődési vizsgálatok).

Másodlagos szerkezet Fehérjék esetében a távoli UV tartományban (180nm - 260nm) - az amid kromofóroktól kapunk jelet. 190-240 nm közt a CD spektrum az amid csoportok egymáshoz képesti orientációjára jellemző → Ha más a másodlagos szerkezet, más a CD spektrum.

Tiszta másodlagos szerkezetek CD spektruma -hélix -turn rendezetlen szerkezet -redő Ebben a tartományban (190-240nm) adott fehérje CD spektruma a „tiszta” másodlagos szerkezetek CD spektrumának lineárkombinációjaként írható.

Lineárkombináció Ismeretlen fehérje CD spektruma = referencia CD spektrumok lineáris kombinációja -hélix rendezetlen szerkezet -redő

Illesztés Referencia spektrumként: tiszta másodlagos szerkezetek CD spektruma (szintetikus polipeptidek). Vagy valós fehérjék. (Programok legalább 2, de max. 8 féle komponenst használnak).

Eredmény A mért CD spektrum alapján megkapjuk a vizsgált proteint alkotó másodlagos szerkezetek százalékos arányát. Másodlagos szerkezetek

rendezetlen szerkezet -redő Mivel a három alap konformáció (-hélix, -redő, rendezetlen szerkezet) CD spektruma igen különbözik egymástól, kis, lokális konformációs változások is szembetűnő változásokat okoznak a CD spektrumban. -hélix -hélix -redő rendezetlen szerkezet

A ribonukleáz hődenaturációja -hélix rendezetlen szerkezet Jobbra: 0.02% Ribonukleáz A, (0.001M HCl) CD spektruma 10, 20, 30, 40, 50, 55, 60, 70, 80 °C-on. Balra: A CD-jel a hőmérséklet függvényében (222nm-en).

Köszönöm a figyelmet!