 fág Lambdoid fágok P22 P2, 4 P1 Mu Mérsékelt fágok  fág Lambdoid fágok P22 P2, 4 P1 Mu

A mérsékelt válasz jellemzői A fág növekedése szabályozott Lizogénia Profág Felülfertőzési rezisztencia (immunitás) Ha a profág a citoplazmába jut indukálódik Indukálható (DNS sérülés hatására, SOS) Defektív fág, amelyben valamely funkció hiányzik Kriptikus, ha nem termel fertőző virionokat Turbid plakk (a sejtek egy része lizál, míg egy része lizogén lesz, amely növekszik a plakk belsejében) cos vég, ragadós vég 12 bp hosszan (ebből 10 GC)

 lítikus ciklus Fág adszorpció Maltóz transzport segíti (a baktérium maltóz transzport rendszere szükséges hozzá) RNS transzkripció („jobb” és „bal” irányba, a DNS különböző szálairól, PR és PL promóterről) Immediate early, delayed early és late transzkriptumok Antiterminációval keletkezik a kései átírás N fehérje RNS polimerázhoz köt Lassít a terminátor helynél, de nem áll meg Processzív antitermináció, ha az RNS polimeráz stabilan megváltozik, sosem tud terminálni Q fehérje későbbi gének antiterminációja

Korai szabályozás Cro represszor (control of repressor and other things) felülkerekedik és a PL PR promóterek működnek Majd az antiterminációval a kései gének is bekapcsolnak

DNS replikáció A  DNS, bejutás után cirkularizálódik a cos végek segítségével, a gazda ligáz enzimje kovalensen összekapcsolja ori replikációs origótól indul a szintézis A fág O és P fehérjéje kell a replikációhoz A gazda chaperone rendszere is kell hozzá Cirkulárisan 1-2 replikációs ciklus (theta) Ezután átvált „rolling circle” replikációra Ehhez a kései gének kellenek A gam gén gátolja a gazda exonukleáz enzimjét, így a rolling circle replikációban keletkező egyszálú DNS nincs kitéve degradációnak

A  fág érési folyamata Hasonló a T4 fághoz Termináz enzim (ter) felismeri a cos régiót cosB-t ismeri fel és cosN-nél hasít Mint egy asszimmetrikus II-es típusú restrikciós enzim A hasításhoz szükséges még gazda faktor (IHF, integration host factor) A termináznak 2 cos hely kell (1½) Konkatemer esetén megvan a 2 (1½) cos vég Replikáció elejéről marad cirkuláris DNS, ebben csak 1 cos hely van, azaz nem tudna bepakolódni Két cirkuláris DNS rekombinációjával konkatemer keletkezik, amelyben már 2 cos régió van, így bepakolódik (scavenging pathway) Sejt lízis R endolizin, a peptidoglikán vázat hasítja (lizozimhoz hasonlít) S holin, pórusokat képez a membránon, melyen keresztül kijut az endolizin

Fágfej érése (váz fehérje, bakteriális chaperon szükséges)

Lizogén ciklus Integráció Két cirkuláris molekula között Campbell típusú rekombinációval attB (baktérium) és attP (fág) közötti helyspecifikus rekombináció (BB’, PP’, rekombináció után BP’, PB’)

Integráció lehetőségei A gazda általános rekombinációs rendszere rec A fág saját rekombinációs rendszere red Fág integráz (int) ez a legfontosabb Campbell rekombináció megfordítható folyamat, tehát a kivágódás ugyanígy történhet De az integráz fehérje nem ismeri fel a PB’ helyet A kivágódáshoz nélkülözhetetlen a xis (excizionáz), ez felismeri a PB’ helyet

A lizogén állapot A lizogén állapot fenntartásáért a cI represszor a felelős Ha nincs cI, akkor virulens (vegetatív) fázis Zigotikus indukció, lizogén Hfr törzs konjugációjakor (nem lizogén recipienssel) kiszabadulnak a fágok A recipiens citoplazmájában nincs cI, ezért a cro represszor felülkerekedik, kialakul a lítikus ciklus A cII és cIII segíti a cI hatását A cI feladata Aktiválja saját promóterét (PM fenntartó promóter) Represszálja a jobb és bal (PL, PR promótereket az OL és OR operátorokon keresztül) A cro represszorral az operátor különböző helyeit gátolják cI OL1, OR1 cro OL3, OR3

Immunitás A cI másik tulajdonsága az immunitás kialakítása Saját fággal újrafertőzés nem történik homoimmunis Ha más fág felülfertőzését is gátolja, heteroimmunis cI represszor megakadályozza a további fágfertőzést Gátolja az integráz működését, nem lesz több beépülés Beépülés csak általános rekombinációval lehet a másik fág közepébe, ekkor mindkét fág rekombináns Heteroimmunis fág beépülhet többszörös lizogénia Ennek kükönleges esete, ha a lambda fág imm régióját kicserélik más lambdoid fág imm régiójával Ekkor az integráz katalizálta rekació során az att helyre épül be, tandem lizogénia, mindkét fág intakt

A tandem dilizogén homológ rekombinációval egyszeres lizogénné alakul

Lizogén állapot kialakítása A lizogén állapot kialakítása komplex folyamat Fertőzéskor korai jobb és bal L1 R1 transzkriptum keletkezik Az ezekről termelődő cI, cII, cIII, Cro hatása dönti el, hogy a lizogénia vagy virulens szakasz győz-e Ha a lizogénia kialakult, akkor már a cI egymagában elég!

cI fehérje két promóterről íródhat át PE, PM, establishment (kialakító), maintenance (fenntartó) promóter PE expressziókor a cro represszort is gátolja, antiszensz PM expresszióját önmaga aktiválja OL és OR-nél represszál

A lizogén/lítikus ciklus kialakításában cII a legfontosabb cII, cIII szabályozza A cI expresszióját És az int expresszióját a PI promóterről A lizogén/lítikus ciklus kialakításában cII a legfontosabb A PI és PE –35 régiójához köt Az RNS polimeráz  alegységéhez kötve fejti ki hatását A cII, cIII és a gazda hflB proteáza (a cII-t bontja) szabályozó ciklust alkot

Aktiválja a PE, PI promótert cII akkumulálódik Aktiválja a PE, PI promótert Az aktivitása nem túl erős, mert a gazda hflB proteáza bontja Ha a gazda proteáz génje mutáns, akkor nagy arányú lizogénia alakul ki Normális lizogén ferekvencia úgy alakul ki, hogy a cIII gátolja a hflB proteázt Ezzel a szabályozással mindig van aktivitás (bár alacsony szintű)

A represszor cI átíródik cII köt a PE-hez A represszor cI átíródik Hatására sok cI represszor keletkezik Cro reverz transzkripció (inaktiválás) Kialakul a lizogénia PE-ről nem tartható fenn a transzkripció, mert a cI köt az OR, OL operátorhoz (PE sem működik így) cII, cIII transzkripció megáll Kialakul a PM-ről a transzkripció

A cI autoregulációja A cI ekkor már önmaga aktiválja a PM promótert Transzkripció a PM-ről mindaddig fennmarad, amíg cI van a sejtben Ha túl sok cI van a sejtben, akkor az OR operátor leginkább baloldali részét is represszálja A cI transzkripciója csökken Ha kevesebb cI van, akkor nem gátolja az OR baloldali részét Újra normális mennyiségű cI transzkripció lesz A cI-vel együtt íródik át a rexAB is, amely a T4RII mutáns fág növekedését gátolja

cII úgy aktiválja az integráz promóterét, hogy az mRNS nem tartalmazza a xis fehérje riboszóma kötőhelyét (így az integrálódott DNS nem szabadul ki újra)

A  genetikai térkép Vegetatív fág térképe Profág térképe Mivel az attP nem a cos régiónál van De az integráció az attP-nél A vegetatív fág és profág térképe egymás cirkuláris permutációi

Vegetatív fág térkép Standard fág keresztezésből Egyszerűbb, mivel nincs cirkuláris permutáció és terminális redundancia, mint a T4-nél A vegetatív térképen a késői gének a két szélen helyezkednek el szeparálva Figyelembe véve a profág integrációt attP-nél, a kései gének egymás mellett vannak

Fizikai térkép A távolságok nem rekombinációs gyakoriságon, hanem aktuális távolságokon alapulnak Heteroduplex analízis Rekombináns fág vizsgálatakor a nem homológ részen buborék keletkezik A buborék távolsága a térképegység Restrikciós térképezés Restrikciós hasítóhelyek elhelyezhetők a genetikai térképen A restrikciós fragmensek nagysága meghatározza a hely távolságát

 fág alkalmazása Szekvenáláshoz nem jó (dupla szálú) Nagy fragmens klónozható 20 kb (nem esszenciális részeket kihagyjuk) Automatikus pakolás A klónozandó fragmenst a bal és jobb kar közé ligáljuk Fertőzött coli sejt kivonatával megtörténik a DNS pakolása (in vitro)

Cosmid Cos végek közé DNS darab In vitro pakolás Így a DNS bejuttatható a coliba Génkönyvtár készítéséhez ideális 40 kb klónozható

 fágvektorok Klónozáskor nem jó, ha a vektor saját maga ligálódik (a klónozandó darab hiányzik) Lambda vektornál, ha nincs inzert, akkor a DNS darab kisebb, mint 47 kb, azt a fág nem pakolja be Ami bepakolódott biztosan tartalmaz rekombináns DNS darabot A lacZ gént is beleépítették (kék fehér szelekció) Replacement vektorok A belső részt kicseréljük az inzertre Az eredeti (belső) fragmens red, gam, amely spi+ fenotípusú Az spi+ P2 fág gátlásra érzékeny Ha klónozó gazda P2 lizogén, akkor ott az eredeti fragmenst (red, gam) tartalmazó gazdát lizálja a fág A végeredmény az, hogy amelyik gazda kinő, az biztosan tartalmazza a klónozandó fragmenst

Más lambdoid fágok Sok lambdához hasonló fág Genetikai szerkezetük hasonlít A kódolt gének nem feltétlenül A lambdoid fágok különálló fág DNS darabok rekombinációval jöttek létre A hasonló funkciók hasonló helyen találhatók Előfordul, hogy a funkció nem marad meg, de az elhelyezkedés igen HK022 (Hong Kong) fág N fehérje génje hiányzik, helyette nun gén található N-terminálisa nagyon hasonlít az N-hez A Nun fehérje verseng a BoxB kötésért az N fehérjével Ebben az esetben nem lesz antitermináció, csak akkor, ha sok N fehérje van jelen

P22 fág Salmonella fág Morfológiája a T3-hoz hasonlít Poliéderes fej, hat tüskéjú alap A DNS lineáris, cirkulárisan permutált, terminálisan redundáns A fej fehérje kialakulásához szükségesek a gazda chaperon fehérjéi P22 körré záródik a terminálisan ismétlődő részek közötti rekombinációjával Ehhez az erf (essential recombination function) génre van szükség Az abc géntermék (cro) kikapcsolja azokat a funkciókat,a melyek a lizogéniához vezetnek

proA, proB gének közé integrálódik (Campbell) Lítikus ciklus DNS replikáció Rolling circle replikáció Fejméretű pakolás Mérsékelt válasz proA, proB gének közé integrálódik (Campbell) 2 fehérje tartja fenn a lizogén állapotot C2 (cI-hez hasonló) mnt gén (represszor) Mnt represszor két átfedő promóterhez köt Ezzel saját transzkripcióját aktiválja ant antirepresszor transzkripcióját represszálja Az ant antirepresszor a normál represszor molekulákat inaktiválja Nem specifikus, más egyébként nem idukálódó fágot is indukál azok represszorának inaktiválásával Genetikai térképe hasonlít a lambdáéhoz (taxonómiailag nem azonos, de genetikailag nagyon hasonlít)

P2, P4 fág Nagyon hasonlóak Kivéve a fejméret P4<P2 P4 genom is < P2 genom DNS-ük teljesen különbözik, kivéve a cos régiót, amely ugyanaz A fágfej ugyanabból a fehérje alegységekből épül fel A P2 a lambdához nagyon hasonló A P2 kb. 10 helyre integrálódhat a coli genomba Ha megtörtént az integráció, nem lehet indukálni (csak nagyon alacsony szintű spontán indukció van) Represszora nem érzékeny a bomlásra (két aminosav hiányzik a cI-hez képest) Vegetatív ciklusban rolling circle replikációval DNS pakoláshoz egy cos vég kell csak

P4 fág Fágmid vektor Csak helper fággal tud szaporodni Fertőzéskor vagy alacsony kópiaszámú plazmidként Vagy nagy (30-50) plazmidként (fazmid) Replikáció theta (bidirekcionális) A helper fág pakoló mechanizmusát használja fel (P2) Szatellit fág, parazita, amely egy másik fág rendszerét használja Csak együttes (P2, P4) fágfertőzés esetén szaporodik a P4 a represszorok keresztszabályozása miatt Fágmid vektor Nagy méret Könnyen bejuttatható a sejtbe Nem kell megölni a sejtet (nincs lízis)

P1 fág Profág autonóm plazmidként található Nagyméretű fág Cirkulárisan permutált, terminálisan redundáns Ca++ szükséges az adszorpcióhoz Ha a farok összehúzódik a farokszálak leesnek (csak ennél a fágnál) Lítikus ciklus DNS cirkularizálódik Kezdetben theta, majd rolling circle replikáció Profág autonóm plazmidként található Ritkán integrálódhat Többszörös replikációs origója van Pakolás a pac helyet felismerve konkatemerből Géntérképe lineáris (ellentétben a cirkuláris DNS-sel Mert extenzív rekombináció van a loxP helynél a cre gén hatására

Mu fág Nem indukálható mérsékelt vírus Leghatékonyabb transzpozon Fertőzés után cirkularizálódik Minden esetben integrálódik a genomba (függetlenül lítikus, lizogén) Az integráció nem Cambell típusú rekombinációval, hanem konzervatív transzpozícióval Két végén gazda DNS Egyik végén 150 bp, másikon 1-2 kb Ezek random darabok A fág integrációjához konzervatív transzpozíció szükséges, ez majdnem random, mert a két végen található darab minden fágban más és más Ha beépül egy génbe, stabilan ott marad, mutáció alakul ki

Mérsékelt fágok  fág Lambdoid fágok P22 P2, 4 P1 Mu