Heterológ fehérje-termelés prokarióta expressziós rendszerekben

www.wzw.tum.de/gene-quantification/ mrna.html

Indukálható promóter rendszer; Újra a vektorokról A baktérium expressziós vektorok néhány tulajdonsága: Indukálható promóter rendszer; Ki-be kapcsolás Fehérje fúziós tag; Tisztítás, oldhatóság www.qiagen.com

Általános tanácsok prikarióta génexpresszióhoz Leggyakoribb hibák: 1. Intront ne felejtse el kivágni 2. Ellenőrizze az inzert orientációját 3. Fúzió frame-ben legyen 4. Nincs poszttranszlációs modifikáció = nem biztos, hogy aktív a termék

Intronok Nem probléma, ha cDNS-t klónozunk www.wzw.tum.de/gene-quantification/ mrna.html

Az inzert orientációja: alkalmazzon inkompatibilis ragadós végeket www.bch.bris.ac.uk/staff/ pfdg/ teaching/genes.htm

Fúziós fehérjék. Ha fúziós fehérjét kíván expresszáltatni, akkor győződjön meg arról, hogy mindkettő ugyanabban a leolvasási keretben van-e www.bch.bris.ac.uk/staff/ pfdg/ teaching/genes.htm

Poszttranszlációs modifikáció Golgi van az eukarióta sejtekben, a prokariótákban nincs nucleus Golgi

Trans-Golgi Network RER = Rough endoplasmic reticulum P R O T E I N A perth.uwlax.edu/faculty/howard/

E. coli-ban mindez nincs glikozilezés – E. coli-ban mindez nincs Cis -Golgi Medial -Golgi Medial -Golgi Cis –Golgi Medial -Golgi

Az expresszió hatékonysága E. coli-ban Függ a: 1. Promóter és terminátor típusa 2. mRNS affinitása a riboszómához 3. A transzgén kópiaszáma és helyzete (kromoszóma, vagy plazmid) 4. A fehérje végtermék lokalizációja a sejtben 5. A transzláció hatékonysága a gazdában 6. A fehérje termék stabilitása a gazdában Génről génre optimalizálni kell a rendszert Nincs egységes stratégia

A transzkripciót befolyásoló tényezők Promóterek (szabályozhatók is) Prokarióta!! 2. Terminátorok Prokarióta!!

Baktérium promóter Pribnow box Promoter search Open promoter complex http://www.blc.arizona.edu/marty/411/

A prokarióta promóterek közötti különbség kicsi, de fontos lehet http://www.blc.arizona.edu/marty/ 411

UP elem erősebbé teheti a promótert (RNS polimeráz kötődés) Core promoter FIS sites UP element UP element

FIS protein = DNS kötődés és hajlítás (binding and bending) FIS helyek a baktérium promótereknél növelik az expressziót

nem működnek E. coli-ban Eukarióta promóterek csak első pillantásra hasonlítanak a prokarióta promóterekhez Minden szekvencia más, euk. promóterek nem működnek E. coli-ban http://linkage.rockefeller.edu/wli/pic/promoter.gif

Prokarióta terminátorok hasznosak

Egy jó transzkripciós terminátor erősen javítja a transzláció hatékonyságát Korlátozza az átírást, plazmid replikáció, stabilitás!

A transzlációt befolyásoló tényezők 1. Riboszóma kötő hely (RBS) 2. Kodon használat 3. mRNS stabilitás

Riboszóma-kötőhely (Ribosome binding site (RBS)) = <10 nt A gén 5’ végén a hajtű kerülendő (GC tartalom minimális legyen) A második kodon vizsgálata; Jó ha AAA – lizin (13.9% az E.coli géneknek). 15x-ös növekedés.

Néhány gént teljesen újra kell szintetizálni. kodon preferencia tRNS ellátottság a gazdában. Néhány gént teljesen újra kell szintetizálni. Gln (Q) CAA 97.0 CAG 3.0 Leu (L) TTA 55.5 CTC 9.7 CTA 4.7 CTG 0.7

Kodon használat: E. coli ↔ ember

Kodon optimalizálás Új gén kémiai szintézis Másik gazda Módosított gazda tRNS-ek termeltetése

További optimalizálásnak gyakorlati jelentősége nem volt. human HG expressziója Dictyostelium-ban (eukarióta példa, de E. coli-ban is hasonló problémák) human chorionic gonadotropin Dictyostelium –ban (AT >75%) Kodon használat %. 4-5x-ös növekedés. Érdekesség: csak az első 15-17 as volt fontos (5’-specifikus hatás, riboszóma megáll és leesik). További optimalizálásnak gyakorlati jelentősége nem volt.

Kereskedelmi E. coli törzsek ritka kodon génekkel BL21 (DE3) CodonPlus-RIL (AT-rich compatible) arginine (AGG, AGA), isoleucine (AUA) and leucine (CUA) BL21 (DE3) CodonPlus-RP (GC-rich compatible) arginine (AGG, AGA) and proline (CCC) Rosetta or Rosetta (DE3) AGG/AGA (arginine), CGG (arginine), AUA (isoleucine) CUA (leucine)CCC (proline), and GGA (glycine)

RNS transzkriptum stabilitás Prokariótákban a legtöbb mRNS kis félélet-idejű Növelni, több idő a transzlációhoz Az 5’ és a 3’ szekvenciák befolyásolják az RNáz érzékenységet Kevés az információ

Fehérje stabilitás Proteáz aktivitás a sejtben 2. N-terminális aminosav szekvencia 3. Belső szekvencia motívumok növelik a proteolízis lehetőségét P prolin E glutaminsav S szerin T treonin …. PEST aminosavak mutációja….

Proteáz hiányos gazda BL21, E. coli expresszió, lon (citoplazma) ompT (periplazma). Nem lehet mindet, mert proteázok kellenek a metabolizmushoz.

N-terminális aminosavak hatása béta-galaktozidáz fehérje stabilitására + az N-terminálishoz ½ élet-idő Met, Ser, Ala > 20 óra Thr, Val, Gly Ily, Glu > 30 perc Tyr, Gln ~10 perc Pro 7 perc Phe, Leu, Asp, Lys 3 perc Arg 2 perc (gyilkos)

PEST szekvencia a humán CFTR fehérjében (cystic fibrosis) P prolin E glutaminsav S szerin T treonin

Idukálható baktérium promóterek Miért nem konstitutív, nagyon erős promóter? A szaporodáshoz idő kell A rekombináns (idegen) fehérje gyakran toxikus. A baktériumok a káros plazmidokat igyekeznek elveszíteni. indukció

BL(DE3) indukálható rendszer és a pET vektorok (Novagen) yfg expressziója az erős promoterről pET23 T7 RNS polimeráz gén kromoszómába integráltatva a lac promóter és operátor szabályozása alatt 2) Laktóz analóg, IPTG, gazda termeli a T7 RNS polimerázt 3) Az E. coli gazda genomban ott a lacI (represszor) gén 4) Megbízható, pontos szabályozás, stabil gazda, szaporítás és termelés külön fázis

CRP CRP CAP = catabolite gene activator protein = CRP T7 polimeráz cAMP T7 polimeráz

pETBlue: a lacZ gén a másik szálon Kék-fehér screening

A legtöbb transzmembrán fehérje toxikus az E. coli-ra A lac rendszer alap expressziója már elég (leaky promóter, szivárog), hogy a gazda ne, vagy csak nagyon rosszul növekedjen inducer nélkül is

Hogyan előzhető meg a szivárgás? lacIq és lacIsq – mutáns E.coli törzsek “quantity” és “superquantity” represszor; Rengeteg represszor, de indukálható A célfehérje mennyisége a sejtekben IPTG

ARABINÓZ OPERON szigorúbb szabályozás… ara operon Arabinóz izomeráz - araA - arabinóz → ribulóz Ribulokináz- araB – ribulózt foszforilezi Ribulóz-5-foszfát epimeráz - araD – ribulóz-5-foszfát→xilulóz-5-foszfát, tovább a pentóz foszfát útvonalba.

L(+)Arabinóz szükséges az expresszióhoz Glükóz van (nincs cAMP) arabinóz van → expresszió nincs Ara represszor CAP cAMP Ara represszor Az AraC (Ara represszor) represszálja a cAMP kis koncentrációjánál a saját szintézisét és represszálja az AraBAD szintézist, amíg nincs arabinóz. Ara

Az arbinóz koncentrációjától függ az expresszió mértéke.

Indukció drága vegyület nélkül Hőmérséklet növeléssel (ts fehérjék)

Pl promótert a cI represszor szabályozza (λ fág)

Hömérséklet szabályozás 28-32 ºC permisszív hőm.; Represszor stabil A célgénről nincs expresszió hőérzékeny cI 857 mutáns P 42 ºC nem-permissziv hőm.; Represszor inaktív Célgén erős expressziója Represszor szintézis TARGET GÉN

Triptofán operon – jól ismert

TRP operon alapú két-plazmid rendszer Nincs triptofán gén !

Hova menjen megtermelt fehérje? kiválasztás (!!) E. coli nem tudja Inclusion bodies (oldhatatlan) Citoplzma (oldható) Periplazmatikus tér (oldható/oldhatatlan)

Szignál szekvencia Gene III, fd fág periplazmatikus térbe

Hogyan tisztítsuk ki a fehérjénket?

Fúziós tag segítségével 6xHIS Tag (Invitrogen, Life Technologies, Novagen, QIAGEN):

GST – fúzió. Glutationhoz kötődik

Új generáció : önmagát levágó fúzió Intein

centrális Homing Endonuclease Region az inteinekben, bifunkciós (DNS-t is vág)

New England BioLabs, pCYB Vectors/IMPACT System http://www.the-scientist.com/yr1997/sept/profile2_970901.html CBD 5kDa chitin-binding domain Bacillus circulans

Specifikus proteáz hasító hely Factor Xa Proteáz (Ile-Glu-Gly-Arg) www.qiagen.com