Szántay Csaba ?! SOTE, 2006 május 10
POTENCIÁLIS ÜZENETEK NMR mint szerkezet- kutatási eszköz a kutató gyógyszeripari K+F+QC MS
Ez még nem definiálja a szerkezetet! CH 3 CH 2 OOC C 22 H 26 N 2 O 2 konstitúció
4 különböző sztereoizomer (azonos mólsúly, különböző térszerkezet) = 4 különböző molekula! (biológiai hatás, szintézis, stb…)
Pl. metabolit szerkezetfelderítés (ID) Pl. MS alapján + 16 OH azonos mólsúlyú regioizomerek ? CH 3 CH 2 OOC
Pl. metabolit ID Pl OH Nem elég bebizonyítani, hogy pl. ITT van az OH… !
? A térhelyzetet is tudni kell (konfiguráció) !
Egy szerkezet ismerete = konstitúció megállapítása, regio- és sztereoizomerek megkülönböztetése + azonosítása, a mért spektrális jellemzőkkel konzisztens egyéb szerkezetek MEGFONTOLÁSA, ezek tudatos KIZÁRÁSA !
NMR komplementer információ MS elemi összetétel konfiguráció konformáció dinamika MÓLSÚLY (HRMS, LRMS)↓ összegképlet… + fragmentáció konstitúció (regioizomerek)
NMR MS konstitúció (regioizomerek) konfiguráció konformáció dinamika valójában: non-invazív mérési módszerek sokasága (több ezer, nagyon különböző időigénnyel!)
THE NMR MAGNET Probe AZ NMR MÁGNES
H RF pulzus
több pulzus egymás után különböző irány, erősség, hosszúság, frekvencia pulzus szekvenciák:
Mindennek mi értelme??? A szomszédok “látják” egymást! Többdimenziós spektrumok is készíthetők: a kötéseken és téren át ható atomi kapcsolatok mérhetők és jellemzőek a (tér)szerkezetre!
1H1H 19 F 31 P 13 C 15 N
HOMONUCLEAR 2D COSY (COrrelation SpectroscopY) HAHA HBHB HAHA HBHB Kötéseken keresztüli kapcsolatok: H A és H B csatolnak 3 J(H A, H B )
HETERONUCLEAR 2D 1 H- 13 C HSQC (Heteronuclear Single Quantum Correlation) HAHA H Bx HAHA H By Kötéseken keresztüli kapcsolatok: H A - C A és H Bx, H By – C B skalárisan csatolt magok. 1 J(H A, C A ) – közvetlen csatolás H Bx H By CACA CBCB CACA CBCB
HETERONUCLEAR 2D 1 H- 13 C HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Correlation) HBHB HCHC HCHC HBHB Kötéseken keresztüli kapcsolatok: H B, H C, H D és C A egymástól három kötésnyi távolságra. 3 J(H B, C A ) – távolható HDHD HDHD CACA CACA
HOMONUCLEAR 2D NOESY (Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY) HAHA HBHB HCHC HDHD HAHA HBHB HCHC HDHD Téren keresztüli kapcsolatok: H A, H B, H C, H D csatolnak NOESY intenzitás ~ r -6
f(t) F( ) FT
H
H
A szerkezetmeghatározás IDEÁLIS esete (SOK és TISZTA mintánk van) ?
Példák a szerkezet megfejtésének illusztrálására 1 H-NMR RGH C spektrum 1 H spektrum NMR:
A spektrumok együttes értelmezésével egyértelműen eldönthető, hogy “ki kicsoda”! Asszignáció
A különböző NMR mérések segítségével egyértelműen (de nem könnyen!) megfejthető a szerkezet!!!
NMR+…NMR+… lélektanlélektan
Az NMR-es szerkezetbizonyításnak különböző szintjei vannak!
t A „konzisztencia” teljesülése: A szerkezetvizsgálat adott mélységéig az NMR adatok elfogadható mértékben egybevágnak az elképzelt szerkezettel!
A konzisztencia teljesülése nem FELTÉTLENÜL jelenti azt, hogy MEGFEJTETTED a szerkezetet!
Pl.(!): H H-H-NOE 1D TOCSY COSY HSQC HMBC C H-N-HMBC C-H-NOE N ADEQUATE INADEQUATE S/N igény Az NMR szűrő Z 1 Z 2 Z 3 Z 4 Z 5 Z 6 Z 7 Z7 Z7 “PROTONISZTIKUS” NMR (jó ha mérhető) “HOLISZTIKUS” NMR (NMR igazi ereje)
1 H, 13 C NMR alapján: OK tiazolidin N-fenil szukcinimid VÁRT: ÁMDE! AGNO 3 -tal titrálható: gyűrűs imid ???
Pl.(!): 1 H 13 C HSQC COSY H-H-NOE C-H-NOE
? !
A megfejtésnek örülhetünk DE vajon hány lehetséges MÁS izomert zártunk ki tudatosan?
a gyenge pont… ~ mg ! S ignal N oise
NMR MS ELŐNY: rendkívüli érzékenység ( LRMS) HÁTRÁNY: ezen túlmenően csak perifériás információ (fragmentáció) ELŐNY: mély és egzakt molekuláris információ + dinamika HÁTRÁNY: viszonylag érzéketlen (> mg !!!) MS: NMR:
pg ng gg mg NMR MS NMR MS tradicionális szerepkör: elsősorban szintetikus munka támogatása A NMR érzéketlensége nem jelent problémát megfelelő mintamennyiség esetén: MS + (HOLISZTIKUS) NMR információ összeadódik, MS fragmentációs zónára nincs igazán szükség…
Szintézis-támogató ID, tipikus protokoll: ? NMR MS ! (+ IR) (+ dinamika)
? A szerkezetmeghatározás KELLEMETLEN esete KEVÉS mintánk van (KEVERÉK?)
pg ng gg mg NMR MS metabolitok, apró szennyezők… MS
Mikro-komponens ID, tipikus (tradicionális) protokoll: NMR LC MS ?! ?
Tipikus metabolit ID helyzet MS alapján: HO OH
Tipikus metabolit ID helyzet MS alapján: OH
Tipikus metabolit ID helyzet MS alapján: OH ?
preparatív HPLC NMR Ha végképp nem megy NMR nélkül: hosszadalmas preparatív HPLC munka (költség, idő) min. 20 mg NMR-re
NMR LC NMR MS CÉL Mikro-komponens ID MS
NMR & MS: Mi történt (történik) ennek érdekében a világban az utóbbi időben?
pg ng gg mg NMR MS Érzékenység növelés + Miniatürizálás HRMS + MS-MS
Pl.: mért LR mólsúly = 163 C 9 H 10 N 2 O C 10 H 14 N 2 = = LRMS: nem tud különbséget tenni! HRMS: 1. mérni tudja a pontos mólsúlyt! 2. mérni tudja a különbséget!
LTQ-FT MS Norcotinine elméleti móltömeg: mért móltömeg: Nicotine elméleti móltömeg: mért móltömeg: NEW !
SNSN 500 MHz Súly: 533 kg 900 MHz Súly: 7200 kg NEW !
1 H 60 MHz 1 H 500 MHz 1 H 900 MHz S/N=20:1S/N=900:1S/N=2700:1 S/N változása a mágnes térerő függvényében S/N ~ B 0 7/4
hűtött (“krio”) mérőfej SNSN NEW !
“Krio fej” 3-4 szeres érzékenység növekedés! Pl. 10-ed mérési idő !!! (KVANTITATÍV fejlemény) Egy sereg mérés kivitelezhetővé válik! Pl. C spektrum ! 2D spektrumok !!! (KVALITATÍV fejlemény) NEW ! KVANTITATÍV KVALITATÍV
60 g gHMBC ; 18 óra KRIO-fej napig tartana konvencionális mérőfejjel ! NEW !
VÉGEREDMÉNY: néhány g minta protonisztikus NMR g minta holisztikus NMR
Az ÚJ (technikai) lehetőség: ? NMR MS ! (+ IR) (+ dinamika)