A sejtciklus és szabályozása

A sejt teória kialakulása A sejt szerkezeti, fiziológiai és szerveződési egysége minden élő rendszernek. A sejt létezhet önálló egységként vagy szervezetek felépítő egységeként. A sejtek más sejtek közreműködése nélkül a kristályok keletkezéséhez hasonlóan jöhetnek létre. (spontán kialakulás) 1838 Matthias Schleiden Theodor Schwann Omnis cellula e cellula (minden sejt egy másik hasonló létező sejtből származik) 1858. Omnis cellula e cellula (minden sejt egy másik hasonló létező sejtből származik) 1858. A modern sejt teória Minden ismert élő rendszer sejtekből áll. A sejt minden élő rendszernek strukturális és funkcionális egysége. Minden sejt osztódással keletkezik egy másik sejtből. A sejtek örökítő információja sejtről sejtre adódnak át az osztódás során. Minden sejt alapvetően azonos kémiai felépítésű. Az élő rendszereket jellemző energia áramlás és átalakítás a sejtekben történik. Robert Virchow

A sejtciklus = két periódus szabályos váltakozása a sejtek életében - a sejttartalom megkettőzése (interfázis) - kettéosztódás (M-fázis) M-fázis interfázis

A sejtciklus áttekintése I. Pontosan szabályozott DNS tartalom - replikáció + szétválás és (kromatin) (kromoszóma) centroszóma S fázisban mitózis alatt  genetikailag azonos sejtek Nem pontosan szabályozott citoplazma - növekedés + osztódás G1 és G2 citokinézis M-fázis = mitózis + citokinézis G2 G1 S Interfázis = G1+ S+ G2

A sejtciklus áttekintése II. események, folyamatok jól ismertek hogy regulálódik? sejtciklus szabályozó rendszer ciklin dependens kinázok (Cdk-s) ciklinek foszfatázok egyéb kinázok (Aurora, Polo) ciklin dependens kináz gátlók (CKI) ubiquitin ligáz ellenőrzési pontok: G1,(S),G2,M univerzális és konzervatív 3 típus: korai embrionális standard emlős (soksejtű) M G2 G1

Kinázok és foszfatázok működése A foszforilálás aktiválja vagy inaktiválja a fehérjéket = szabályozza a működésüket Egy fehérjének több különböző hatású foszforilációs helye lehet. Poszttranszlációs szintű szabályozás.

Ubiquitin – függő proteolízis aktiváló konjugáló ligáló enzim (specifikus)

Cdk szabályozása proteolízis proteolízis kinase foszfatáz kinase

A fő ellenőrzési pontok G1, G2, M Is all DNA intact? A sejt akkor lépi át az ellenőrzési pontot, ha az azt megelőző folyamatok hibátlanul megtörténtek

2001 Orvosi Nobel díj Leland Hartwell Paul Nurse Tim Hunt ellenőrzési pontok Cdk ciklin

Standard sejtciklus M-fázis egysejtűek (élesztő) M reguláló rendszer Cdk + G1 ciklin  SPF vagy Start kináz Cdk + M ciklin  MPF 3 ellenőrzési pont M G2 G1 Az első Cdk = cdc2 vagy p34

MPF Cdk SPF Cdk szabályozása a standard sejtciklusban M-fázis G2 G1 S M ciklin  M-fázis MPF G2 Cdk M ciklin  G1 G1 ciklin  SPF S G1 ciklin  - szintézis  - degradation

M-fázis promoting factor aktiváció ciklin Aktiváló kináz MPFi MPFi Cdk Gátló kináz foszfatáz MPFa

A standard sejtciklus szabályozása  Gátló kináz foszfatáz  proteolízis Szubsztrát-PO4 + Ciklin(ek) Cdk MPF szubsztrát transzláció transzláció G1 és M ciklinek lebontása MPF aktivációja (aktiváló kináz és foszfatáz) és gátlása (gátló kináz) Aktiváló kináz

Soksejtűek sejtciklusa

A sejtciklus eltérő szerepe egy- és soksejtűekben A sejtek addig osztódnak, amíg valamely kedvezőtlen környezeti körülmény le nem állítja (negatív) a sejtciklust. Felnőtt szervezetben a sejtek addig nem osztódnak, amíg a környezetükből stimulust (pozitív) nem kapnak.

Soksejtűekben a sejtek sorsa jórészt a környezetüktől (más sejtektől függ) Survival

Soksejtűek sejtciklusa Go fázis növekedési faktor  G1 fázis letapadási függőség  G1 fázis denzitás függő sejtosztódás gátlás (kontakt gátlás) (kevés növekedési faktor) M-fázis M G1 G2 Go G2 Restrikciós pont -Növekedési faktor -letapadás S

A soksejtűek sejtciklusát számos Cdk és ciklin szabályozza

Soksejtűek Cdk-i és ciklinjei Cdk – ciklin komplex ciklin Cdk G1-Cdk Ciklin D (G1 ciklin) Cdk 4, 6 G1/S-Cdk Ciklin E (G1/S ciklin) Cdk 2 S-Cdk (SPF) Ciklin A (S ciklin) M-Cdk (MPF) Ciklin B (M ciklin) Cdk 1

Növekedési faktorok Go  G1 átmenethez szükségesek fehérjék ( 50); enzim kapcsolt receptoruk van parakrin szekréció nagyon specifikusak; esetleg kombinációban hatásosak hatásaik koncentráció függőek a pontos hatásuktól függően csoportjaik: mitogének, növekedési faktorok, túlélési faktorok pl. EGF, FGF, PDGF, NGF stb.

A növekedési faktorok hatásmechanizmusa 1. Aktivált tirozinkináz kaszkád Aktivált Ras (monomer G protein) Aktivált szerin/treonin kináz kaszkád (MAP-ok=mitogén aktivált proteinek) 2. Transzkripciós faktorok 3. Korai válaszgének transzkripciója (c-jun,c-myc,c-fos) 4. Jun,Myc,Fos transzkripciós faktorok szintézise 5. Késői válaszgének transzkripciója 6. Cdk-k és Dc (és sok egyéb) szintézise 7. Visszalépés G1-be

A letapadás is lehet sejtciklus indukáló Autofoszforilációs hely Extracelluláris mátrix Integrin Plazmamembrán Kináz domén FAK MAP kináz Src Sos Grb FAK = fokális adhéziós kináz

A Cdk inhibitorok két családja INK4 család – p14, 16, 18, 19 – csak a Cdk4/6 –ot (kapcsolódást a ciklinnel és az aktivitást) gátolja CIP/KIP család – p21, 27, 57 – elsősorban a Cdk2-E/A aktivitását gátolják

Visszalépés a G1 fázisba M G1 Restrikciós pont S Stimuláció Gátlás pRb-PO4 Cdk2 - Ec Cdk4/6- Dc  Dc pRb-E2F p107,130 p21,27,57 Go p14,15,16,19 E2F p53 Ac Ec Növekedési faktor letapadás DNS sérülés Cdk2- Ac

Myc transzkripciós faktor target génjei: Cyclin D SCF=ubiquitin ligáz E2F

S fázis

DNS szintézis iniciálása I. ORC az origókhoz (sok ezer) kapcsolódik Más fehérjék bekötődése Pre-RC

DNS szintézis iniciáció II. Cdk2-Ac aktivitás A DNS replikálódik, de csak egyszer (Cdk2-Ac) 1.A DNS replikáció iniciálódik 2. Az új iniciáció gátolt (ORC defoszforilálódás a mitózis után)

S fázis iniciáció Kromatin remodelling Sok origó (replikáció start pontja)  hosszú DNS ORC (origo felismerő komplex) bekötődése Cdc6 bekötődése Egyéb fehérjék bekötődése  pre-RC SCF (ubiqutin ligáz)  p27 degradáció  Cdk2-Ec aktiváció Cdk2-Ec aktiválja a Cdk2-Ac-t Cdk2-Ac foszforilálja a pre-RC elemeit (pl. Cdc6-ot) DNS replikáció (de csak egyszer !)

DNS szintézis (egy replikációs origó) 5’ 3’ 3’ 1. 2. 3. 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ RNS primer

S fázis (DNS szintézis) 2 replikációs villa (replikációs buborék) primáz  RNS primer DNA polimeráz 5’ 3’ monomerek: dezoxinukleozid trifoszfátok leading (vezető) és lagging (elmaradó) szál primer kivágása ligáz szemi-konzervatív Azonos DNS molekulák

A hisztonkorongok elrendeződésének két modellje =

End replication problem és a megoldás = telomeráz

Protoonkogének és tumor szupresszor gének termékei A sejtciklust serkentik gátolják Cdk-k, ciklinek, pRb, CKI-k növekedési faktorok stb. (ras gyakori) (p21, p53 stb) Tumor szupresszor protoonkogén

A sejtciklust szabályozó gének szerepe a tumorok kialakulásában protoonkogének Tumor szupresszor

A p53 központi reguláló szerepe

A p53 szabályozása és működése DNA damage induces phosphorylation (P) of p53 (at the Mdm2 binding site) and Mdm2, preventing Mdm2 from binding to p53. As a result, the p53 level increases, and stops cells from entering cell cycle until the DNA is repaired. If repair fails, p53 initiates apoptosis (programmed cell death). Mechanisms resulting in a decrease in p53 steady-state levels are indicated with green arrows and those resulting in increases p53 levels are indicated with red arrows. Solid lines indicate active mechanisms and broken lines indicate inactivated mechanisms. Ubiquitin ligáz

Protoonkogének és tumor szupresszor gének a humán kromoszómákon

A sejtciklust szabályozó gének konzervatívak, univerzálisak

Fehérjék csoportjai, amelyek a sejtek növekedését szabályozzák. Mutációjuk oka lehet a tumorok kialakulásának.

Knudson hipotézise a tumor szupresszor gének szerepéről a tumorok kialakulásában Két találat teória, LOH = loss of heterozygosity

Retinoblasztoma Kisgyermekkorban a retinában kialakuló tumor Oka az RB1 gén csíravonalbeli mutációja Kb. fele öröklődő és a fele sporadikus

Li-Fraumeni szindróma Oka a p53 mutáció Öröklődő – fiatalkori tumorok (emlő, agy, sarcoma, akut leukémia)

A tumorok jellemző tulajdonságai

A vastagbél rák kialakulásához is sok mutáció vezet Adenomatous polyposis coli

Wnt fehérjék – konzervatív morfogének, sejt differenciálódás, polaritás, embrionális fejlődés, tumorok

Hepatocarcinoma kialakulása

Centroszóma ciklus

A centroszóma (MTOC) és a centriolumok szerkezete mikrotubulusok centriolumok  tubulin gyűrűk

Centroszóma ciklus M Cdk1+Bc (MPF) Cdk2+Ec G2 G1 eltávolodás szétválás Cdk2+Ac S duplikálódás

Tumorokban gyakori az atípusos mitózis (tripoláris) Három centroszóma

M fázis

Nagy változások az M fázisban DNA (blue), microtubules (red) nuclear envelope marker (green) Nagy változások az M fázisban Interphase metaphase anaphase telophase

M-fázis promoting faktor aktiváció ciklin Aktiváló kináz MPFi MPFi Cdk Gátló kináz foszfatáz MPFa

Néhány MPF szubsztrát nukleáris lamina laminjai  magmembrán szétesése Golgi membránban GM130 (COPI borított vezikulum dokkoló fehérje)  Golgi is vezikulumokra esik szét kondenzin  kromoszóma kondenzáció (H3 hisztont egy másik kináz foszforilálja) MAP-ok  mitotikus orsó kialakulása foszfatáz (+ feedback) APC (anaphase promoting complex)  aktiváció miozin  inaktiváció

A mitózis fázisai Interfázis korai profázis késői profázis prometafázis Metafázis korai anafázis késői anafázis késői telofázis A metafázisban működik az M ellenőrzési pont.

Magmembrán szétesése MPF Laminok foszforilációja Interfázis Profázis Foszforilált A és C lamin Foszforilált B lamin a magmembrán vezikulumokon

DNS-től a kromoszómáig A DNS kondenzációját a kondenzin foszforilációja indítja el. telomérák

Kohezin Kondenzin Cornelia de Lange szindróma

Kohesin és kondenzin Smc = structural maintance of chromosome + egyéb proteinek

A centroméra és a kinetokor nem ugyanaz

szerkezete és kimutatása A kinetokor régió szerkezete és kimutatása

Scleroderma Autoimmun betegség – kinetochor elleni autoantitestek

Mitotikus orsó (metafázis) asztrális kinetokor poláris mikrotubulusok polar

A mitózis fázisai Interfázis korai profázis késői profázis prometafázis Metafázis korai anafázis késői anafázis késői telofázis Ha metafázisban (M ellenőrzési pont) minden kromatidához megfelelő módon kapcsolódnak kinetochor mikrotubulusok, a sejt folytatja a mitózist…

Anafázis promoting komplex (APC) APC = ubiquitin ligáz  poliubiquitinált fehérjék  proteaszóma MPFa (M fázis elején)  APC (anafázis elején) szekurin lebomlás B ciklin lebomlás   szeparáz MPFi  ? kohezin MPF szubsztrátok defoszforilálása Anafázis, citokinézis

APC hatása kohesin leválása testvér kromatidák szétválása (anafázis) proteasome kohesin leválása testvér kromatidák szétválása (anafázis)

Anafázis (Kinetochor MT depolimerizáció – no ATP) (Poláris MT polimerizáció és sliding)

Miozin II változása a sejtciklusban

Citokinézis (aktin és miozin II) Cytokinesis signals the end of 1 round of the cell cycle and the generation of 2 daughter cells. -It begins shortly after the onset of anaphase and is triggered by the inactivation of cdk1. -In Animal cells, cytokinesis is mediated by a contractile ring of actin and myosin II filaments that forms beneath the plasma membrane. -The location of the ring is detemined by the location of the mitotic spindle. Cleavage proceeds as contraction of the actin and myosin filaments pulls the PM inward. This eventually results in pinching the cell in half causing the production of 2 daughter cells

Citokinézis – kontraktilis gyűrű aktin miozin

Citokinézis (SEM,TEM)

Regulációs stratégiák az emlős sejtciklusban Gátló kináz foszfatáz proteolízis    Szubsztrát-PO4 CKI-k  +  ciklin Cdk CKI-k szubsztrát  proteolízis transzkripció Aktiváló kináz transzláció

Hogyan működnek az ellenőrzési pontok? G1 G2 M DNS sérülés szabad kinetokor nem teljes replikáció érzékelő protein kinázok közvetítő effektor s e j t c i k l u s m e g á l l í t á s a

G1 ellenőrzési pont A DNS sérülés érzékelése p53 foszforiláció Protein kináz p53 foszforiláció közvetítő effektor p21 transzkripció -In addition to CHK1 and CHK2, in mammalian cells G1 arrest is also mediated by a transcription factor and tumor suppressor gene called p53. -p53 is phosphorylated by both ATM and CHK2. In the case of the p53 protein, phosphorylation serves to stabilize a protein that would otherwise be rapidly degraded. -This stabilization, allows levels of p53 to increase so that p53 can activate transcription of the gene that encodes the Cdk inhibitor, p21. Activation of p21 leads to inhibition of Cdk2/cyclinE complexes. -If you recall from a few slides back, we said the Cdk2/cyclin E are necessary for progression from G1 to S. So as a result this interaction causes cell cycle arrest at the G1 checkpoint. -Another interesting note, it that p53 is the most commonly mutated protein in human cancers. Mutations that result in the loss of p53 function prevents G1 arrest in response to DNA damage. This allows damaged DNA to divide without being repaired. The inheritance of damaged DNA results in an increased frequency of mutations, general instability of the genome of those cells and tends to contribute to cancer development. Cdk2-Ec gátlás No S fázis

Ataxia telangiectasia (ATM) Rendkívül sokféle, sok szervet érintő tünet együttes sugár érzékenység és tumorok kialakulása

G2 ellenőrzési pont ATR Protein kináz érzékelő közvetítő effektor

BRCA (breast cancer) szerepe a DNS sérüléseinek a kijavításában Mutációjuk – emlő és petefészek tumorokban

M-ellenőrzési pont Van szabad kinetochor Minden kinetochorhoz kapcsolódik MT APC Cdc20 APC

Egyéb kinázok a sejtciklus szabályozásában

Polo szerű kinázok (Plk1) szerepe az M-fázisban Plk1 lokalizáció Plk inhibitorok – (BI2536, GSK461364, ON-01910, HMN-214) – I-II fázisú klinikai kipróbálás

Aurora kináz A sötét kék, Aurora kináz B narancs