III. Sz. Belgyógyászati Klinika A biostatisztikai elemzés helye az orvostudományban III. A klinikai epidemiológia és populációgenetika alapfogalmai és az alkalmazott statisztikai módszerek Dr. Prohászka Zoltán Az MTA doktora Semmelweis Egyetem III. Sz. Belgyógyászati Klinika 2013-05-09 prohoz@kut.sote.hu

Epidemiológia A betegségek előfordulásának leírása, az okok feltárásának segítése A genetikai és környezeti tényezők együttes hatásának vizsgálata, ill. törekvés ezek közötti különbségtételre Genetikai epidemiológia: a betegségek esetleges öröklődésének vizsgálata, genetikai meghatározttságuk igazolása, feltárása

A genetikai epidemiológiai módszerekkel megválaszolható kérdések Van családi halmozódás? Van arra utaló adat, hogy a betegség genetikai meghatározottságú? Kimutatható valamely genetikai modell? Hol található a betegséget meghatározó gén? Mi a betegség keletkezésének mechanizmusa?

A(z genetikai) epidemiológia során használt fogalmak, módszerek, folyamatok Deskriptív epidemiológia: hipotézis generálás Breast Cancer (C50), World Age-Standardised Incidence Rates, Females, World Regions, 2008 Estimates http://info.cancerresearchuk.org/cancerstats/types/breast/incidence/uk-breast-cancer-incidence-statistics

Hipotézis generálás genetikai epidemiológiai adatokkal Nemzetközi variabilitás a fenotípusban Életkorra illesztett incidencia és prevalencia adatok Migrációs vizsgálatok Környezeti és genetikai meghatározottság közötti különbségtételre ad lehetőséget Rasszok, etnikumok és szocio-ökonomikus csoportok közötti különbségek elemzése Admixture vizisgálatok (beházasodás) Nemi különbségek X és Y kromoszómához kötött betegségek, hormonális hatások, környezeti-viselkedési hatások Életkor hatása Családi halmozódású betegségforma általában hamarabb kezdődik, mint a sporadikus (pl. retinoblasztoma: two-hit model)

A genetikai epidemiológia során használt módszerek, folyamatok Deskriptív epidemiológia Családi halmozódás: hipotézis alátámasztása Genetic studies into inherited and sporadic hemolytic uremic syndrome Warwicker and Goodship, 1998

Családvizsgálatok Fenotípus: folytonos vagy diszkrét? Családfa: Nuclear family, beteg-pár, teljes család, ikrek és case-control vizsgálat (pl. emlőrákosok rokonai vs. biztosan nem azok) Gyakorlott kérdező és előzetes kérdéssor a biztosítéka a pontos adatok nyerésének Ikervizsgálatok Adoptációs vizsgálatok Vérrokonság

A genetikai epidemiológia során használt módszerek, folyamatok Deskriptív epidemiológia Családi halmozódás Szegregációs vizsgálat: a genetikai modell tesztelése A családok tagjain tett megfigyelések (fenotípus) alapján felépített genetikai modellek vizsgálata (molekuláris adatok nélkül) Egy vagy több génes-e betegség? Öröklésmenet domináns, recesszív, ko-domináns, egyéb?

Washington University (www)

Modes of inheritance

A genetikai epidemiológia során használt módszerek, folyamatok Deskriptív epidemiológia Családi halmozódás Szegregációs vizsgálat: a genetikai modell tesztelése Linkage analízis Asszociációs vizsgálat Fogékonysági vagy rizikó gének felismerésére alkalmas módszerek

ROCHE Genetic Education (www)

Differences between linkage and association Linkage is a property of loci Association is a property of alleles Role: * To identify a biological mechanism for transmission of a trait * To locate the gene involved * To identify association between an allelic variant and a disease * To identify linkage disequilibrium between a disease allele and a marker Coarse mapping (>1cM) Fine mapping (<1cM) No information about which allelic variant associated with higher risk of disease   Require family pedigrees Case-control or family based approach Use very polymorphic markers Usually bi-allelic markers

Linkage analízis Felhasznált elvek: A különböző kromoszómákon található gének egymástól függetlenül szegregálódnak Az egy kromoszómán található gének közötti fizikai távolság növekedésével a rekombináció valószínűsége nő Érintett családok több tagjában is meghatározásra kerülnek polimorf, ismert lokalizációjú markerek Rekombinációs események követhetőek, melyből a feltételezett lókusz pozíciója nagyjából meghatározható LOD-score módszer (LOD: logarithm of likelihood ratio) Beteg testvér módszer Finomtérképezés LD-map Haplotipizálás, szekvenálás Loss-of heterozygosity

Asszociációs vizsgálatok Populációs (case-control) Családi (proband-parent trio, transmission-disequlibrium test)

Odds Ratio: 3.6 95% CI = 1.3 to 10.4 ROCHE Genetic Education (www)

Milyen okok vezethetnek inkonzisztens eredményekhez asszociációs vizsgálatokban? Betegek (fenotípus) és kontrollok eltérő definiálása Genetikai heterogenitás populációk között Random error Tervezési és kiertékelési különbségek Fenotípus nem megfelelő definiálása (az is betegcsoportba kerül, aki valójában nem beteg) Kontroll csoport nem megfelelő választása (betegek vagy rokonok is bekerülnek) Alcsoport/ high-throughput analízis esetén a többszörös összehasonlítás eredményének korrekciója elmarad (Bonferroni) Kis mintaszám A replikációs vizsgálat mellőzése

Hum Genet. 1991 Apr;86(6):595-8. A marked drop in the incidence of the null allele of the B gene of the fourth component of complement (C4B*Q0) in elderly subjects: C4B*Q0 as a probable negative selection factor for survival. Kramer J, Fülöp T, Rajczy K, Nguyen AT, Füst G. Department of Immunopathology, National Institute of Haematology and Blood Transfusion, Budapest, Hungary. Ann N Y Acad Sci. 2003 Dec;1010:496-9. An age-associated decrease in the frequency of C4B*Q0 indicates that null alleles of complement may affect health or survival. Arason GJ, Bödvarsson S, Sigurdarson ST, Sigurdsson G, Thorgeirsson G, Gudmundsson S, Kramer J, Füst G. Department of Immunology, Institute of Laboratory Medicine and Department of Medicine, Landspítali University Hospital, LSH Hringbraut, 101 Reykjavík, Iceland. garason@landspitali.is

A fenotípus….

A genetikai meghatározottság elemzése genotype frequencies allele frequencies genotype frequencies: rr 200 white Rr R500 pink RR 300 red 200/1000 = 0.2 rr 500/1000 = 0.5 Rr 300/1000 = 0.3 RR total = 1000 flowers

Describing genetic structure genotype frequencies allele frequencies 200 rr 500 Rr 300 RR = 400 r = 500 r = 500 R = 600 R allele frequencies: 900/2000 = 0.45 r 1100/2000 = 0.55 R total = 2000 alleles

A Hardy-Weinberg elv 1.0 = p2 + 2pq + q2 Az aktuálisan evolúciós hatásnak ki nem tett populáció génkészlete több generáción keresztül egyensúlyban marad, azaz teljesül az elv Feltételezve, hogy egy jelleget a lókusz p és q alléljei határoznak meg, érvényesül hogy 1=p+q (allélfrekvenciák összege) Azaz a genotípusok eloszlására érvényes a következő összefüggés (Hardy-Weinberg egyenlet): 1.0 = p2 + 2pq + q2  Ahol: p2 = az AA genotípus gyakorisága 2pq = az Aa genotípus gyakorisága q2 = az aa genotípis gyakorisága

A HW elv teljesülése A HW elv egy ideális helyzetre vonatkozik (modell) A valós helyzet lényegesen eltér ettől A HW elv ideálistól való eltérését okozzák Ha az egyedek nem diploidok Vannak ivartalan szaporodási események A generációk átfedőek A párválasztás nem véletlenszerű A populáció mérete nem végtelen (korlátozott) Az allélfrekvenciák eltérőek a nemekben Van migráció, változik a mutációs ráta és szelekció érvényesül

A HW elv teljesülésének tesztelése kísérleteink, vizsgálataink során Kötelező A kontroll minta genotípus eloszlásának adott pillanatban meg kell felelnie a HW egyensúlynak Ha egy minta genotípus eloszlása eltérést mutat a HW egyensúlytól, az több dologra utalhat: Genotipizálási hiba (kontroll csík!!) Mintavételezési hiba Szelekciós, mutációs hatás vagy egyéb tényezők (rokonházasság, nem random párválasztás, migráció, nemi kapcsoltság)

Milyen analízist végezhetünk a különböző öröklésmenetű betegségek esetén?

A chi-négyzet próba Tegyük fel, hogy 200 személyt vontunk be vizsgáltunkba, a csoport fele beteg, míg másik fele képezte a kontrollt A 200 személy közül 50 esetében találtunk rizikó genotípust, míg 150 személynél nem. Csoport Beteg Kontroll Nem rizikó genotípus 150 Rizikó genotípus 50 100 200

Várható (expected) előfordulási gyakoriság A chi-négyzet próba Ha a rizikó genotípus és a betegség között nem állna fenn kapcsolat (azok függetlenek lennének), akkor a betegek és a kontrollok csoportjában az emberek 25–25%-a esne a rizikó genotípus kategóriába (null-hipotézis). A várható előfordulási gyakoriságokat a táblázat széli gyakoriságaival (marginal frequency, a sorok és oszlopok összesített értékei) számíthatjuk ki, feltételezve, hogy ezek a számok adottak egy vizsgálatban. Várható (expected) előfordulási gyakoriság Csoport Beteg Kontroll Nem rizikó genotípus 75 150 Rizikó genotípus 25 50 100 200

A megfigyelt gyakoriságok A chi-négyzet teszt alapfeltevése az, hogy a várt és a megfigyelt eloszlási gyakoriságok között nincs különbség Ha a táblázat oszlopait és sorait meghatározó jellegzetességek egymással kapcsolatot mutatnak, akkor a várt és a megfigyelt eloszlások egymástól lényegesen eltérnek Az eltérés mértékét fejezi ki a chi-négyzet értéke. Esetünkben a betegcsoportban jóval nagyobb a rizikógenotípus frekvenciája, mint a kontroll csoportban, vagyis levonhatjuk azt a következtetést, hogy a betegség kapcsolatban van a rizikó genotípussal, a chi-négyzet értéke utal a kapcsolat erősségére. Megfigyelt (observed) előfordulási gyakoriság Csoport Beteg Kontroll Nem rizikó genotípus 60 90 150 Rizikó genotípus 40 10 50 100 200

A példa számaival végzett chi-négyzet próba eredménye Szabadsági fok: p-értéke: Egy- vagy kétoldalas a p? 24,00 1 <0,0001 Két oldalas Relatív kockázat (RR) (95% CI) Esélyhányados (OR) (95% CI) 2,0 (1,57–2,54) 6,0 (2,79–12,91) Prospektív kohorsz Eset-kontroll

Az esélyhányados (odds ratio) A esélyhányados a kockázat becslésére szolgál, és leggyakrabban eset-kontroll tanulmányok során találkozunk alkalmazásával. Az OR annak az esélye, hogy egy eseményt elszenvedett személy (beteg) a rizikófaktornak (rizikó allél) ki volt téve, osztva annak az esélyével, hogy egy eseményt el nem szenvedett személy (kontroll) nem volt kitéve a rizikófaktornak Példánk eset-kontrollos vizsgálat volt (induláskor tudtuk ki beteg és ki a kontroll), így helyesen odds ratio-t lehet számolni Példánkban 10* 60/40*90=6

A relatív kockázat (relative risk) A relatív kockázat, melynek jelölése általánosan RR (relative risk), mindig egy adott beteg csoport és egy adott kontroll csoport vonatkozásában fejezhető ki, és az adott betegségre vonatkozik. Kiszámításakor a rizikóhatásnak kitett (exposed) és a ki nem tett (non-exposed) csoportokban megfigyelt betegség incidenciákat osztjuk egymással. A relatív kockázat a két csoport esemény rátáinak hányadosa. Példánknál maradva, a betegség relatív rizikója 40/50 osztva 60/150 azaz 2. Relatív rizikót prospektív kohorsz vizsgálatban lehet megállapítani (induláskor mindenki egészséges). Példánkból helyesen nem lehet relative risket számolni

A genetikai epidemiológia során használt módszerek, folyamatok Deskriptív epidemiológia Családi halmozódás Szegregációs vizsgálat: a genetikai modell tesztelése Linkage analízis Asszociációs vizsgálat Klónozott gének funkcionális vizsgálata Fogékonysági vagy rizikó gének felismerésére alkalmas módszerek

Mutáció < 1% < Polimorfizmus Szekvencia variációk Egyedek közti különbség = 0.1% Mutáció < 1% < Polimorfizmus