Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Alapismeretek Dr. Pongrácz Judit Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011 Dr. Pongrácz Judit Háromdimenziós szövettenyésztés és „tissue engineering” – 1. Előadás Alapismeretek

A kurzus célja Elméleti háttérismeretek komplex szövetkultúrák előállításához

A kurzus tartalma Hét Előadás Cím 1 Alapismeretek 2 Őssejtek (1) 3 4 Őssejtek (3) 5 Bioreaktorok (1) 6 Bioreaktorok (2) 7 Bioanyagok (1) 8 Bioanyagok (2) 9 Scaffold előállítás 10 Biokompatibilitás 11 Sejt-Scaffold kölcsönhatások 12 Biofaktorok 13 Szabályozott hatóanyag leadás 14 Bioszenzorok Hét Előadás Cím 8 15 Aggregációs kultúrák 16 Szövetnyomtatás - Tissue printing 9 17 Tissue repair (1) 18 Tissue repair (2) 10 19 Tissue repair (3) 20 Tissue repair (4) 11 21 Kereskedelmi forgalomban lévő termékek (1) 22 Kereskedelmi forgalomban lévő termékek (2) 12 23 Klinikai kipróbálás (1) 24 Klinikai kipróbálás (2) 13 25 Klinikai kipróbálás (3) 26 Kutatási felhasználás és drogteszetelés 14 27 Etikai kérdések 28 Gazdasági jelentőség

Mi a „tissue engineering”? „Tissue engineering” eredetileg a biológiai anyagtudományok és a mérnöki tudományok egyik mellékágaként jött létre, de mivel az utóbbi időben mind jelentősége, mind művelőinek száma megnőtt, ma már önálló tudományágnak számít. A „tissue engineering” célja specifikus szövetek, illetve akár teljes szervek regenerálása valamint újra-előállítása, a biológiai funkciók megtartása vagy helyreállítása (csont, porc, ér, lép, bőr, stb.) mellett. Ennek érdekében különböző technikák kombinációit használja: sejttenyésztés, bioanyagok szintézise, biokémiai és biofizikai módszerek.

A „tissue engineering” alapjai Biopszia vagy reszekció útján nyert sejtek Beültetés Biopszia Graft előállítása 3D tenyésztés („scaffold”-on vagy anélkül) Felszaporodott sejtkultúra Monolayer sejtkultúra

2D szövetkultúra Adherens Nem adherens Tripszin Tripszin nélkül Szuszpendálás Pelleting Reszuszpendálás Sejtek kirakása

3D szövetkultúrák Egészséges szövet Nekrotikus szövet Elégtelen diffúzió Tápanyagok és oxigén diffúziója Apoptotikus sejthalál Másodlagos nekrózis Egészséges szövet Nekrotikus szövet

Szövetek előállítása In vitro In vivo Szöveti regeneráció (szövet proliferáció és regeneráció mesterséges „scaffold”-on) Bio-mesterséges szervek (máj, bőr, hasnyálmirigy) Vérsejt regeneráció (őssejt proliferáció és differenciáció stimulálása) Sejtinjektálás sérült szövetekbe (szívizomsejtek) Nagy sérülések regenerációja (biológiailag abszorbeálható „scaffold”-ok növekedési faktorokkal illetve nélkül)

Bioreaktor Nekrózis elkerülésére Kevertetett bioreaktor Sav Habzás- gátló Bázis Szubsztrát Kevertetett bioreaktor Ipari bioreaktor Perisztaltikus pumpák Hab Fűtőszál T Szabályozó egység Pumpa pH Bemenő víz pO2 Ellennyomás szelep Biztonsági szelep Kimenő víz Q szelep Elektromágneses szelep hűtéshez Levegő Motor Q

Sejt- és szövetpótló terápia fő alkalmazási lehetőségei Stroke Traumás agysérülés Alzheimer kór Parkinson kór Foghiány Sebgyógyulás Csontvelő transzplantáció Gerincvelő sérülés Oszteoarthritis Rheumatoid arthritis Kopaszság Vakság Süketség Miokardiális infarktus Muszkuláris disztrófia Diabétesz Multisite daganat Amiotrófiás laterális szklerózis

A „tissue engineering” során használt sejtek Őssejtek Embrionális Köldökzsinórvér Csontvelő- vagy zsírszövet-eredetű Felnőtt, szövetspecifikus Érett, differenciálódott sejtek Szövetspecifikus

Őssejtek (1) Dr. Pongrácz Judit Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011 Dr. Pongrácz Judit Háromdimenziós szövettenyésztés és „tissue engineering” – 2. Előadás Őssejtek (1)

Őssejtek Totipotens Pluripotens Multipotens

Őssejt típusok Megtermékenyített petesejt 8 sejtes embrió Blasztociszta Tenyésztett őssejtek Idegsejtek Vérsejtek Totipotens Pluripotens Agy Idegsejtek Csontvelő Vérsejtek Multipotens Multipotens

Az őssejt osztódásának típusai I. Önmegújítás Aszimmetrikus osztódás, differenciáció Önmegújító leánysejt Leánysejt Szimmetrikus osztódás Szimmetrikus, osztódás, differenciáció

Az őssejt osztódásának típusai II. Proliferációs képesség Differenciációs képesség Aszimmetrikus osztódás Sejtszám megsokszorozódás Progenitor sejteken át történő differenciáció Őssejt Véglegesen differenciálódott sejtek Proliferálódó szakasz

Őssejt források Felnőtt (szomatikus) őssejtek (Adult Stem Cells, ASC) Felnőtt multipotens őssejtek Embrionális őssejtek (ESC)

Epiblaszt őssejtek (EpiSC) I. Az epiblaszt olyan szövet, amely az embrionális őssejtek kialakulását követő későbbi fejlődési szakasz során jön létre. Kialakulása az embrió beágyazódása után történik.

Epiblaszt őssejtek (EpiSC) II. Embrionális ivarsejtek (EG) Extraembrionális endoderma (XEN) sejtek Trofoblaszt őssejtek (TS) Embrionális őssejtek (ESC) Epiblaszt őssejtek (EpiSC) IPS sejtek Primitív endoderma Trofektoderma (TE) Epiblaszt Szomatikus sejtvonalak Endoderma Mezoderma Ektoderma Dedifferenciáció Újraprogramozás Megtermékenyítés Primordiális ivarsejtek(GSC) Szedercsíra Késői blasztociszta

A multipotens felnőtt szomatikus őssejtek lokalizációja Korábban azonosított: Agy A közelmúltban gyakorlatilag minden szövetben mutattak ki őssejteket Bőr Csontvelő

Felnőtt (szomatikus) őssejtek (ASC) A mikrokörnyezetet, ahol az őssejtek elhelyezkednek, őssejt „niche”-nek nevezzük Zsírszövet-eredetű őssejtek Perifériás vér Csontvelő Vázizomzat Méhlepény Szőrtüsző Porc Harántcsíkolt izom Bőr Izom Ideg Ín Simaizom Agy Csont Vérsejtek Szív Zsír Máj Agy/Ideg Vér Minden szövet ASC:

Gasztrointesztinális A felnőtt őssejt niche Mikrokörnyezetként leírt őssejt niche-k: Gasztrointesztinális Agy Csontvelő Nyelőcső Cornea Vékonybél Idegek Retina Vastagbél/colon Vérsejtek Hasnyálmirigy Gyomor Izom Máj Minden szövet Szív Tüdő Spermatogónium Amnion folyadék Köldökzsinór mátrix Köldökzsinór-vér Különböző szövetek

Csontvelői őssejtek (MSCs) Hemopoetikus őssejtek Mezenchimális őssejtek Csontvelői stróma őssejtek Endotél progenitor sejtek

Hemopoetikus őssejtek (HSC) I. ThyloLin-Sca-1+ CD4 és Mac-1 alapján 3 populáció különíthető el, és csak a Lin-Mac-1- CD4- populáció tartalmaz nagyszámú tartósan újraképződő hemopoetikus őssejtet c-kit+Sca-1+ThyloFlk-2: hosszú távú repopulációs képesség c-kit+Sca-1+ThyloFlk-2+: rövid távú repopulációs képesség c-kit+ThyloLin-(Flk-2-) Sca-1+: egérben hosszú távú repopulációs képesség

Hemopoetikus őssejtek (HSC) II. Humán mintákban a CD34 antigén (funkciója nem ismert) expresszálódik További markerek: CD38, CDE90 ésCD133 Thy+CD34+ hosszú távú kultúrák mieloid és limfoid sejtvonalakat egyaránt generálnak Thy-CD34+ nincsenek mieloid és limfoid sejtvonalakat egyaránt generáló hosszú távú kultúrák

Hemopoetikus őssejtek (HSC) III. Humán hemopoézis Multipotens hemopoetikus őssejt (Hemocitoblaszt) Közös mieloid progenitor Közös limfoid progenitor Mieloblaszt Megakarioblaszt Proeritroblaszt (Pronormblaszt) Limfoblaszt B. promielocita N. promielocita E. promielocita Monoblaszt Basofil eritroblaszt Promegakarioblaszt Prolimfocita Polikromatikus eritroblaszt B. mielocita N. mielocita E. mielocita Promonocita Ortokromatikus eritroblaszt (Normoblaszt) B. metamielocita N. metamielocita E. metamielocita Megakariocita Kis limfocita Természetes ölősejt Polikromatikus eritrocita (Retikulocita) B. band N. band E. band T limfocita B limfocita Trombociták Eritrocita Basofil Neutrofil Eozinofil Monocita Hízósejt Mieloid dendritikus sejt Limfoid dendritikus sejt Makrofág Plazmasejt

Mezenchimális őssejtek (MSC) I. Nincsenek hemopoetikus markereik (CD2, CD3, CD4, CD8, Mac-1/CD11b, CD14, CD15, CD19, CD20, B220, CD45, Thy1 és mieloperoxidáz) Expresszió: LDL receptor, alkalikus foszfatáz, simaizom aktin, IV-es típusú kollagén, laminin, VII-es faktor, MUC18, CD29, CD44, CD49A-F, CD51, CD73, CD105, CD106, CD166+

Mezenchimális őssejtek (MSC) II. MSC-k csontvelőből közvetlenül izolálhatóak NGFR (CD271), SSEA-1, SSEA-4, CD140b , CD340 (HER-2), CD349 (Frizzled-9) expresszió alapján Tisztítás: CD29+, CD44+, CD73+, CD105+, CD106+, CD166+, valamint a hemopoetikus receptorok hiánya alapján

Endotél progenitor sejtek (EPC) Felnőtt EPC-k CD34+ vagy Flk-1+ (VEFR- 2) További markereik: CD31, Tie2 és E- szelektin, eNOS, LDLR, VEGFR-1,-2,

Csontvelői progenitor sejtek HSC és EPC sejtvonalak hasonló temporális és spatiális fejlődést követnek HSC és EPC közös markerei: VEGFR-2 (Flk-1), SCL/Tal1, Runx1 Hemangioblaszt fenntartása

Szövetvonalak ontogenezise a csontvelőben Hemangioblaszt (Flk-1+, VEcadherin+, CD45-) Mezo-Angioblaszt HSC Oszteoblasztok MSC EPC Stróma sejtek Periciták SMC Limfoid progenitorok Mieloid progenitorok Monociták EC T-sejtvonal B-sejtvonal

A csontvelői őssejtek funkcionális egymásrautaltsága Mátrix proteinek, adhéziós molekulák, citokinek sorát expresszálja HSC MSC EPC