Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Fehérjék pótlásán alapuló terápiák Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetése az Európai Unió új társadalmi kihívásainak a Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011 Tőzsér József Molekuláris Terápiák – 5-6. előadás Fehérjék pótlásán alapuló terápiák

Fehérjéken alapuló terápiák Hiányzó vagy hibás fehérjék pótlása (pl. inzulin) Szignálútvonalak befolyásolása (pl. interferonok) Növekedési faktorok pótlása (pl. PDGF) Hemosztázis befolyásolása (pl. tPA) Molekulák lebontása enzimekkel (pl. aszparagináz) Fehérjevakcinák alkalmazása (pl. rekombináns HPV vakcina)

Példák pótolt fehérjékre Inzulin (diabétesz) Albumin (hipoalbuminémia) Laktát (laktóz intolerancia) VIII-as faktor (vérzékenység) IX-es faktor (vérzékenység) Protein C (protein C deficiencia) Béta-glükocerebrozidáz (Gaucher kór)

Példák terápiás fehérjekészítményekre Humulin (inzulin) Novolin (inzulin) Flexbumin 25% (albumin) Lactaid (laktóz) ReFacto (F VIII) BeneFix (F IX) Ceprotin (aktivált protein C)

Terápiás fehérjék Az első "fehérje vakcina" alkalmazás a tehénhimő felhasználása volt a feketehimlő megelőzésére (Jenner, 1796) Az első fehérjegyógyszerként az inzulint alkalmazták (Banting és Best, 1922) Az USA-ban már több mint 200 peptid- illetve gyógyszerfehérjét hagytak eddig jóvá terápiás alkalmazásokra A terápiás fehérjék különböző forrásokból származhatnak

Terápiás fehérjék – forrás szerint Fehérje Eredeti forrás Albumin Emberi donor vér Inzulin Sertés, marha pancreas VIII-as faktor Emberi donor vér IX-es faktor Emberi donor vér Kalcitonin Lazac Anti-venom Ló vagy kecskevér β-glükocerebrozidáz Human placenta

Terápiás fehérjék – forrás szerint A természetes forrás gyakran ritka és drága Nehéz a termék izolálása Nehéz az igényeket kielégíteni Immunreakcióhoz vezethet (pl. állati fehérje esetében) virális és patogén szennyezések fordulhatnak elő Napjainkban a legtöbb fehérjegyógyszert rekombináns technológiával állítják elő Olcsóbb, biztonságosabb, korlátlan forrás

Inzulin, az első fehérjepótló gyógyszer 1922 januárjában Banting és Best alkalmazott először inzulin készítményt a 14 éves Leonard Thomson-on. Leonard az injekció hatására még betegebb lett, ugyanakkor a glükóz szintje lecsökkent, ezért a készítmény további javítása és alkalmazása mellett döntöttek. 6 héttel később egy jobb minőségű kivonat már 520 mg/dL-ről 120 mg/dL-re csökkentette a vércukor szintet 24 h alatt. Leonard további 13 évig élt még, pneumóniában halt meg, 27 évesen.

Az inzulin szerkezete Két polipeptid lánc, A.lánc: 21 aminosav B-lánc: 30 aminosav A láncokat diszulfid híd köti össze Az inzulin gén a 11-es kromoszómán található

Terápiás fehérjék – vérből Az emberi test mintegy 6 liter vért tartalmaz. A vér 60-70%-a plazma, 8-9%-a fehérje: ezért jelentős fehérjegyógyszer forrásként szolgál(t). A plazma mintegy 10,000 különböző fehérjét tartalmaz. Mintegy 20 fehérje adja a plazma teljes fehérje-tartalmának a 99%-át Évente több millió liter lejárt transzfúziós plazma keletkezik, ami kiváló, nagy mennyiségben rendelkezésre álló fehérjeforrás

Példák vérfehérje termékekre VIII-as faktor (hemofília korrekció) IX-es faktor (hemofília korrekció) Albumin (hipoalbuminémia korrekció) Intravénás IgG (fertőzésekben) Antitrombin III (véralvadási zavarokban) Alfa I-PI (emfizéma)

A Cohn frakcionálás A Cohn frakcionálás eredeti eljárását 1946-ban dolgozták ki. A Cohn frakcionálás során a vérplazmát differenciális fehérjekicsapásoknak vetik alá, melyben etanolt, pH-változást, kisózást, hőmérsékletváltozást alkalmaznak. A frakciók elkülönítése centrifugálással történik.

Rekombináns technikák Az 1970-es 80-as években fejlesztették ki Paul Berg (1973): restrikciós enzimek Herbert Boyer (1978): az emberi inzulin gén klónozása E. coliban - Genentech Két alapvető megközelítés Izolált sejtekben történő expresszió Expresszió transzgenikus növényben vagy állatban

Véralvadási kaszkád Extrinsic út Intrinsic út X Közös út XIIa XII XIa Ca2+ XI Extrinsic út IXa, VIII PL Ca2+ IX Intrinsic út VII + TF, Ca2+ VIIa TF, Ca2+ X Xa V PL Ca2+ Közös út XIII protrombin trombin fibrinogén fibrin XIIIa + Ca2+ Az intrinsic út mindegyik komponense benne van a véráramban. Az extrinsic útvonalat a TF indítja, mely a véredényen kívülről származik. Kaszkád (lavina) modell. keresztkötött fibrin

Hemofília A és B A hemofília A a VIII-as faktor, hemofília B a IX-es faktor hiányában lép fel Hemofilia A előfordulása férfiakban ~1/5,000 Hemofilia B előfordulása férfiakban ~1/30,000 Recesszív, X-kromoszóma kötött betegségek (az anya tünetmentes hordozó) Terápiában VIII-as vagy IX-es faktor koncentrátum alkalmazható Rekombináns FVIII vagy FIX Génterápiás próbálkozások

Hemofilia A - génterápia Súlyos tünetek (ízületek, létfontosságú szervek spontán bevérzése) csak ha a normál szint FVIII  1 %-a van jelen, ezért kis mennyiségű FVIII biztosítása is terápiás jelentőségű. Az FVIIIexpresszió szoros kontrollja nem szükséges A széles terápiás index következtében a túladagolás kockázata minimális A véráramba juttatása nem igényli a májban történő expressziót A B domén nem szükséges a funkcióhoz, hiányában fokozottabb az expresszió.